基于神經化學分析研究炮制對人參和西洋參藥性的影響

黃鑫 王妮 張娜 越皓 劉淑瑩

摘?要?基于神經化學分析，采用超高效液相色譜-三重四極桿質譜技術，考察了人參、西洋參及其炮制品紅參、西洋紅參對大鼠血漿中神經化學物質的影響。結合化學計量學多元統計分析，采用主成分分析（PCA）和偏最小二乘判別分析（PLS-DA）對數據進行處理，利用判別函數對溫涼藥性進行識別，篩選溫涼藥性潛在特征標記物;利用識別模型獲得各味中藥對應標記物特征值分布，評價人參、西洋參及其炮制品藥性差異。結果表明，基于此神經化學分析方法，共篩選出14種溫性標記物和10種涼性標記物，其中谷氨酸和苯丙氨酸對溫性藥性影響最大，甘氨酸和5-羥色胺與涼性相關性最大。紅參組與人參組中溫性藥性標記物所對應的特征值均為正值且紅參組大于人參組，即紅參藥性為溫，且在藥性上溫的程度甚于人參。西洋參組與西洋紅參組中涼性藥性標記物所對應的特征值均為正值，且西洋參組大于西洋紅參組，即西洋紅參在藥性上涼的程度不及西洋參，揭示了炮制對西洋參藥性的影響。結果表明，神經化學物質的變化可以反映中藥溫、涼藥性對生物體的影響，神經化學分析可用于評價中藥的藥性效應，為中藥藥性差異的物質基礎和藥效作用機制研究提供方法學借鑒。

關鍵詞?神經化學; 人參; 西洋參; 藥性

1?引 言

人參Panax ginseng C. A. Mey與西洋參Panax quinquefolium L.同為五加科人參屬植物，二者主要藥效成分為皂苷類化合物，但所含皂苷的種類、含量及組成不同。人參皂苷對神經系統、內分泌系統和免疫系統等具有雙向調節作用[1]。中藥藥性是中藥作用于生物體所產生的效應，包括寒、熱、溫、涼4種基本屬性，還有微溫、微涼等，各藥性只是程度上的差異，不存在本質區別[2]。人參性溫，味甘、微苦。西洋參性涼，味甘、微苦，凡欲用人參而不受人參之溫補者，皆可以西洋參代之。人參經蒸制加工得到的炮制品為紅參，其性較人參更溫，味甘、微苦。西洋參最常見的加工品為生曬西洋參，而對于其蒸制加工品西洋紅參的研究鮮見報道。西洋紅參的藥性和藥效也尚不明確。因此，研究西洋紅參的藥性和主要功效，對于擴大西洋參的臨床應用具有重要的意義。

中藥藥性是中藥有效成分作用于機體的共性靶標而產生生物效應的高度概括，與中藥化學成分和密切相關，通過特定生物效應體現。中藥藥性研究的方法主要有：從生物熱力學角度，采用微量量熱法探討藥性差異[3]; 建立冷熱板示差法，從物質-能量代謝角度，初步闡明二者藥性差異的客觀真實性[4，5]; 將神經-內分泌功效網絡結合寒證、熱證中醫臨床表現，探討表征藥性分析方法[6～8]; 以典型寒熱中藥為例，利用統計學和模式識別方法，基于模型判別系數和標記特征值分布篩選標記藥性的初生物質成分并識別藥性寒熱程度[9～11]。神經化學是一門新興的交叉學科，將神經學與化學結合起來，研究機體內分泌的多種微量化學物質，主要包括氨基酸類和生物原胺類，這些神經化學物質在中樞神經、心血管和內分泌等系統中發揮著廣泛的調節作用[12～15]。中藥寒熱藥性對神經-內分泌功效網絡系統影響研究表明，溫熱藥可使動物交感神經-腎上腺功能增強、興奮下丘腦-垂體-甲狀腺軸; 而寒涼藥則反之，表明神經化學物質對機體神經內分泌功能有重要調控作用，與機體寒熱狀態關系密切[6～8，16，17]，對評價中藥藥性具有重要意義。已報道研究對于神經化學物質的檢測采用酶聯免疫法、熒光分光光度法、高效液相色譜-電化學法等。本研究應用建立的高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用法，同時快速檢測大鼠血漿中24種神經化學物質含量，此方法的靈敏度、準確性更高，更有利于全面反映藥性差異對于神經系統調控作用的影響?；诖松窠浕瘜W分析，采用多元統計模式識別方法，篩選出與藥性相關的內源性潛在特征標記物，利用標記物特征值分布差異，進而識別西洋紅參的藥性，探討炮制方法對西洋參藥性的影響，為中藥藥性差異的物質基礎和藥理作用研究提供方法學借鑒。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

Dionex Ultimate 3000 超高效液相色譜儀-TSQ Endura三重四極桿質譜儀（Thermo Scientific公司）; Hypercarb色譜柱（100 mm × 2.1 mm，5 μm）、80℃低溫冰箱（Thermo Scientific公司）; BSA224S電子分析天平（賽多利斯科學儀器有限公司）; Bio-Gen PRO 200型精密勻漿器（PRO Scientific公司）; Eppendorf AG 22331 Hamburg離心機（德國Eppendorf公司）; Vortex-Genie2渦旋振蕩器（Scientific Industries公司）。

多巴胺（H110868）、腎上腺素（L137183）、去甲腎上腺素（N107258）、5-羥色胺（S111161）、5-羥基吲哚乙酸（H133485）、酪氨酸（T103976）、甘氨酸（A110749）、谷氨酸（G103978）、谷氨酰胺（G105425）、天冬氨酸（A108708）、?；撬幔═103829）、絲氨酸（S103483）、組胺（H110868）、3，4-二羥基苯乙二醇（D9753）對照品購于阿拉丁試劑公司; 色氨酸（231123）、乙酰膽堿（A0084）、褪黑素（211835）、苯丙氨酸（125942）、3-甲氧基酪胺（913916）、3-甲氧基-4-羥基苯乙二醇（H946340）、3，4-二羥基扁桃酸（D0582）、4-羥基-3-甲氧基扁桃酸（73538）、高香草酸（ASB-00008328-100）、3，4-二羥基苯乙酸（ASB-00004635-100）對照品均購于百靈威試劑公司; 甲醇、甲酸和乙腈（色譜純，Fisher公司）。實驗用水為Milli-Q超純水。

鮮人參和鮮西洋參（4年生）購自吉林省撫松縣，經長春中醫藥大學王淑敏教授鑒定為五加科人參屬人參Panax ginseng C. A. Mey和西洋參Panax quinquefolium L.干燥根。人參和西洋參經鮮參烘干，實驗室自制。紅參和西洋紅參經鮮參蒸制后烘干，實驗室自制。

SD大鼠（SPF級，雄性，180～200 g），購于遼寧長生生物技術有限公司，合格證號SCXK（遼）2015-0001。本實驗經長春中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準。

2.2?實驗方法

2.2.1?色譜與質譜條件?（1）色譜條件?流動相： 0.1%甲酸-甲醇; 流速： 0.2 mL/min; 柱溫： 25℃; 進樣量： 2 μL; 梯度洗脫： 0～3 min，0%甲醇; 3～10 min，0%～100%甲醇; 10～12 min，100%～0%甲醇。（2）質譜參數?電噴霧離子源（ESI），采用正離子模式，多反應離子通道檢測（MRM），毛細管電壓為3.5 kV，離子傳輸管溫度為300℃; 霧化器溫度為300℃; 鞘氣流速40 arb; 輔助氣流速10 arb。

2.2.2?對照品溶液與藥材樣品的制備?分別稱取多巴胺（DA）、 腎上腺素（E）、 去甲腎上腺素（NE）、 5-羥色胺（5-HT）、 5-羥基吲哚乙酸（5-HIAA）、 酪氨酸（Tyr）、 甘氨酸（Gly）、 谷氨酸（Glu）、 谷氨酰胺（Gln）、 天冬氨酸（Asp）、 ?；撬幔═au）、 絲氨酸（Ser）、 組胺（His）、 3，4-二羥基苯乙二醇（DHPG）、 色氨酸（Try）、 乙酰膽堿（Ach）、 褪黑素（Mel）、 苯丙氨酸（Phe）、 3-甲氧基酪胺（3-MT）、 3-甲氧基-4-羥基苯乙二醇（MHPG）、 3，4-二羥基扁桃酸（DOMA）、 4-羥基-3-甲氧基扁桃酸（VMA）、 高香草酸（HVA）、 3，4-二羥基苯乙酸（DOPAC）對照品各5 mg，以0.1%甲酸溶解并定容至5 mL，配成濃度為1 mg/mL溶液。用甲醇稀釋配成不同濃度的標準溶液，用于建立標準曲線。

將藥材粉碎成細粉（過80目篩），稱取藥材粉末300 g，加入8倍量75%乙醇回流提取2次，第一次2 h，第二次1.5 h，濾過，合并兩次濾液，50℃水浴蒸干，并制備成凍干粉，即得各藥材總皂苷提取物，用于配制動物實驗灌胃給藥溶液。

2.2.3?動物實驗及樣本處理?適應性喂養1周后，隨機分為空白對照組、 人參組、 紅參組、 西洋參組和西洋紅參組。生藥4 g/kg，20 mL/kg灌胃給藥，對照組灌胃給予蒸餾水，每天1次，連續8周。

斷頭處死大鼠，取血漿并于冰浴中靜置10 min， 于4℃以12000 r/min離心20 min，取上清液。取100 μL血清，加入400 μL乙腈，振蕩1 min，靜置10 min，于4℃以12000 r/min離心15 min，取上清液，過0.22 μm濾膜，待測。

2.2.4?數據統計?采用多元統計分析軟件（SIMCA-P + 13.0），以各組所測神經化學物質的含量為統計變量，進行主成分分析（PCA）和偏最小二乘判別模式識別分析（PLS-DA）。

3?結果與討論

3.1?神經化學物質超高效液相色譜-三重四極桿質譜檢測分析方法評價

在前期研究工作基礎上，建立24種神經化學物質超高效液相色譜-三重四極桿質譜分析方法[17，18]，質譜采集參數如表1所示。配制混合標準品溶液，采用外標法進行定量分析，各待測物的線性方程、線性范圍、相關系數如表1所示。各待測物的日內精密度RSD為0.9%～9.0%，連續測定3日，日間精密度RSD為1.1%～9.0%，準確度RSD為2.9%～7.0%，加樣回收率為97.5%～103.9%，結果表明，各待測物的精密度和準確度、穩定性滿足分析要求。

3.2?大鼠血漿中神經化學物質分布變化分析

24種神經化學物質在不同組別大鼠血漿中的含量經高效液相色譜-三重四極桿質譜測定，采用多元統計分析（SIMCA-P + 13.0）方法處理數據。以各組所測神經化學物質的含量為統計變量，進行主成分分析（PCA），對所有樣本進行整體評價和區分，以第一主成分和第二主成分為坐標軸構建樣品的得分散點圖（圖1）。第一主成分和第二主成分可代表94.6%的變量信息，即包含了絕大部分的樣本信息。由圖1可見，空白對照組、人參組、紅參組、西洋參組和西洋紅參組區分良好，并且組內相對集中，因此，這4種藥材皂苷組分對神經化學物質具有調節作用。神經化學物質的含量變化可以反映中藥溫、涼藥性對生物體的影響，可用于評價中藥的藥性作用。

3.3?基于神經化學物質的人參、西洋參溫涼藥性特征標記

Zhou等[12]基于典型寒熱中藥初生物質成分建立偏最小二乘模型，利用判別系數成功識別中藥藥性特征標記物。本研究在此基礎上，將偏最小二乘判別模式識別模型（PLS-DA）應用于生物內源性標記物的統計分析來識別中藥溫涼藥性，獲得基于神經化學物質的溫涼藥性相關特征標記物。以識別模型的判別系數作藥性相關特征標記的可視化圖，見圖2，序號1～24分別代表表1中按相對保留時間排序的24種標記物。

由圖可見，24種神經化學物質中與14種藥性標記物的判別系數為正值： 即18： ?Glu、24： ?Phe、17： ?Asp、 1： ?VMA、 2： ?DOMA、 16： ?Gln、 8： ?E、 10： ?Tau、 23： ?3-MT、 22： ?Tyr、 5： ?Ach、 19： ?NE、 21： ?DA、 3： ?DHPG，可判斷其為溫性標記; 而10種藥性標記物的判別系數為負值： 即6： ?Gly、12： ?5-HT、13： ?HVA、9： ?Mel、4： ?His、7： ?Ser、20： ?DOPAC、14： ?5-HIAA、15： ?Try、11： ?MHPG，可判斷其為涼性標記。溫性標記物中Glu的判別系數最大，表明其對溫性藥性影響最大，其次為Phe，而DHPG因判別系數僅為0.0015，對溫性藥性影響不顯著; 同理Gly與涼性標記正相關且相關性最大，其次為5-HT，而MHPG的相關性并不顯著。中藥對溫性標記物和涼性標記物不同程度的影響即可顯示其不同溫涼藥性特征。

經判別系數識別的14種溫性藥性標記物中，Glu由Gln在谷氨酰胺酶的作用下水解生成，在生物體內的蛋白質代謝過程中占重要地位，Gln是大腦的一種能量來源，可改進維持大腦機能。Phe與Tyr一起合成重要的神經遞質和激素，參與機體糖代謝和脂肪代謝。Asp能調節腦和神經的代謝功能。NE甲基化形成E，對心、血管活動、體溫、情緒等多種生理功能起到調節。Tau可改善機體內分泌系統的狀態，對機體代謝進行有益調節。3-MT調節垂體分泌，對心血管活動起興奮作用。Ach主要參于機體心血管活動、攝食、飲水、睡眠、覺醒、感覺和運動的調節[19]。DA參與多種感覺和情緒等生理功能的調節，有提高機體抗應激能力和抗抑郁的作用。綜上可見， 溫性藥性標記物具有促進機體能量代謝，改進機體內分泌系統功能，提高中樞神經系統興奮性等生物活性，決定了溫熱藥能夠調理寒涼證。

而涼性藥性標記物Gly是一個抑制性神經遞質。Ser可以抑制神經元興奮性毒性，發揮保護神經作用。5-HT是調節神經活動的一種重要的抑制性神經物質，參與痛覺、睡眠和體溫等生理功能的調節。Mel有強大的神經內分泌免疫調節活性和清除自由基抗氧化能力。Try是5-HT的前體，5-HIAA作為5-HT的代謝產物以及5-HT可經過轉化合成為Mel，它們可削弱應激反應，調節精神節律和改善睡眠。His是一種化學傳導物質，參與睡眠、激素分泌、體溫調節、食欲等功能?？梢娮R別出的涼性藥性標記物都具有降低中樞神經系統興奮性作用，減弱代謝和應激反應能力，從而顯示寒涼的生物活性。

3.4?基于神經化學物質的西洋紅參藥性標記識別

Zhou等[12]的研究表明，利用特征標記物的特征值分布可判別中藥藥性差異。本研究在此基礎上，采用PLS-DA模式識別方法計算各標記物的特征值并進行比對，以14種溫性標記物和10種涼性標記物的特征值做圖。如圖3所示，溫性標記物和涼性標記物在人參、紅參、西洋參、西洋紅參各組中特征值分布存在明顯差異，并且特征值的大小與藥性溫涼程度具有相關性。

圖3A為人參組各藥性標記物特征值分布，溫性標記神經化學物質所對應的特征值為正值，而涼性標記神經化學物質所對應的特征值為負值，因此，人參表現為溫性。圖3B為紅參組各藥性標記物特征值分布，溫性標記神經化學物質所對應的特征值為正值，而涼性標記神經化學物質所對應的特征值為負值，可判斷紅參為溫性。紅參組中溫性標記神經化學物質所對應的特征值明顯大于人參組，而涼性標記神經化學物質所對應的特征值明顯小于人參組，此結果表明紅參在藥性上溫的程度要甚于人參，與中醫認為人參性微溫而紅參性溫的藥性觀點相一致。因此，應用篩選出的24種標記神經化學物質所對應的特征值分布情況可以判斷中藥藥性溫涼的程度。

與上述結果相似，從西洋參組各藥性標記物特征值分布（圖3C）可知，涼性標記神經化學物質所對應的特征值為正值，而溫性標記神經化學物質所對應的特征值為負值，因此，西洋參表現為涼性。西洋紅參組各藥性標記特征值分布圖（圖3D）中涼性標記神經化學物質所對應的特征值為正值，溫性標記神經化學物質所對應的特征值為負值，可判定西洋紅參也表現為涼性。與西洋參組相比較，西洋紅參組中涼性標記神經化學物質所對應的特征值明顯小于西洋參組，而溫性標記神經化學物質所對應的特征值與西洋參組差異不明顯，由此推斷西洋紅參在藥性上涼的程度不及西洋參。

對比西洋紅參組與人參組各藥性標記物特征值分布圖，人參組溫性標記神經化學物質所對應的特征值為正值，而西洋紅參組涼性標記神經化學物質所對應的特征值為正值，可以判定，炮制后的西洋紅參的藥性較西洋參稍溫，但其整體藥性仍表現為涼性，而人參則表現為溫性。

4?結 論

基于神經化學分析，應用高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用技術，結合多元統計模式識別方法，對人參、西洋參及其炮制品的藥性進行研究。篩選出與溫性相關的潛在特征標記物14種，與涼性相關的潛在特征標記物10種。通過對特征標記物的可視化分析和特征值分布差異分析，印證了傳統中醫認為紅參在藥性上溫的程度要甚于人參的觀點，同時推測出西洋紅參藥性為涼并且涼的程度不及西洋參，揭示了炮制對西洋參藥性的影響。篩選出的藥性相關生物標記物具有調節機體中樞神經系統和內分泌系統功能、調節能量代謝和應激反應能力等方面的生物活性，與中藥寒熱藥性對神經-內分泌功效網絡系統影響研究結果一致。本研究將神經化學分析方法應用于中藥藥性評價，以近緣中藥人參和西洋參為例，利用PLS-DA模式識別方法，基于模型判別系數和標記特征值分布篩選標記藥性的內源性神經化學物質并識別藥性溫涼程度，為進一步深入探討中藥藥性差異的物質基礎和藥效作用機制研究提供了方法學借鑒。

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