基于核酸外切酶Ⅲ輔助雙循環等溫信號放大的高靈敏Hg²⁺傳感方法研究

張何 王青 楊梅 傅昕

摘?要?設計了一種Hg2+觸發的核酸外切酶Ⅲ（Exo Ⅲ）輔助的雙發夾探針雙循環等溫信號放大策略，在此基礎上發展了一種免標記、超靈敏的Hg2+生物傳感器。在Hg2+存在情況下，發夾探針1的3'游離序列與汞離子識別探針通過T-?Hg2+-T配位結合形成雙鏈DNA平末端，核酸外切酶Exo Ⅲ能識別雙鏈DNA平末端并沿3'-5'方向催化水解莖部序列。釋放的Hg2+和識別探針進入新一輪反應循環（循環1）;釋放的發夾探針1未降解序列包含Ⅰ區序列和G-四鏈體形成序列，其中，Ⅰ區序列與發夾探針2的3'游離序列（Ⅰ區序列）完全互補，引發了Exo Ⅲ參與的雙鏈DNA平末端水解，釋放的Ⅰ區序列進入新一輪反應循環（循環2）。循環1和2為自發循環過程，經過多次循環可以產生大量單鏈的G-四鏈體序列。體系中加入氯化血紅素，與G-四鏈體結合形成G-四鏈體-血紅素-DNA酶，催化ABTS-H2O2反應體系顯色?？疾炝硕喾N因素對檢測體系的影響，在最優實驗條件下，此方法對Hg2+的線性檢測范圍為0.3～50 pmol/L，檢出限為0.25 pmol/L（S/N=3），回歸方程為ΔA420 nm=0.117+0.004CHg2+ （pmol/L）。當水樣中存在大量其它金屬離子時，傳感器對Hg2+仍然具有較高的選擇性。將此方法應用于環境水體中Hg2+含量檢測，加標回收率為96.0%～106.0%。本方法操作簡單、選擇性好、靈敏度高、有較強的抗干擾性能，可用于環境水樣中Hg2+的高靈敏檢測。

關鍵詞?等溫信號放大; 核酸外切酶Ⅲ; G-四鏈體-血紅素DNA酶; 汞離子; 比色分析

1?引 言

汞具有非生物降解性和生物蓄積性等特性，即使在低濃度情況下，也能對人體健康造成毒害影響[1，2]，因此，汞污染一直是嚴重的環境問題。水溶性的二價汞離子（Hg2+）是汞最常見和最穩定的存在形式之一[3，4]，近年來，Hg2+污染日益嚴重，因此發展靈敏度高、選擇性好、成本低、通用性強、操作簡便的痕量Hg2+定量分析技術已經成為環境監測的中心任務之一。

目前，用于Hg2+檢測的傳統方法主要包括電感耦合等離子體質譜法[5]、原子吸收發射光譜法[6]、冷蒸氣原子熒光光譜法[7]、電化學法等[8]，這些方法具有較好的特異性、準確性及靈敏度，但依賴精密儀器、操作過程復雜、成本較高等缺點，限制了其在現場檢測的應用。近年的研究發現，胸腺嘧啶（T）與Hg2+之間能夠通過NHg鍵形成T-Hg2+-T結構，并且T-Hg2+-T結構中的NHg鍵比Watson-Crick氫鍵更穩定[9]，由此可以實現Hg2+的高選擇性識別。基于該結構，發展了許多Hg2+檢測新技術，如熒光光度法[10]、電化學方法[11]、表面等離子體共振[12]、表面增強拉曼散射[13]和比色傳感器[14，15]等，但這些方法的靈敏度普遍較低。為了解決Hg2+檢測的靈敏度問題，缺刻核酸內切酶被用于輔助Hg2+循環利用信號放大。Hg2+的存在可以引發缺刻核酸內切酶對含有T-T錯配的DNA二聚體的切割活性，DNA雙鏈結構被核酸酶消化后，Hg2+從T-Hg2+-T結構中釋放出來，并引發新一輪切割。因此，樣品中包含的痕量Hg2+通過循環利用可以產生較高的響應信號[16，17]。但是，由于缺刻核酸內切酶的激活需要識別特定序列，導致Hg2+識別DNA探針的設計比較嚴苛，限制了該類技術的應用范圍。

近年來，由于具有酶激活不依賴特定序列的識別及能夠被T-Hg2+-T特異識別形成的3'平末端高效激活等優點，核酸外切酶Ⅲ（Exo Ⅲ）被廣泛應用于開發選擇性好、靈敏度高的靶標循環利用信號放大新技術[18，19]。然而，近期發展的Exo Ⅲ輔助的Hg2+循環利用檢測策略主要為Hg2+單循環利用技術。Ren等[20]設計了一種通過Hg2+引發末端結合并形成3'平末端的發夾DNA探針，在Exo Ⅲ輔助下，通過Hg2+循環利用放大信號，對水樣中Hg2+檢出限為10 pmol/L; Chen等發展了一種便攜式試紙條生物傳感器用于Hg2+的可視化檢測，該方法通過T-Hg2+-T的特異性識別誘導雙鏈核酸探針形成3'平末端，進而引發Exo Ⅲ輔助的Hg2+單循環利用信號放大，Hg2+檢出限為1 pmol/L[21]。在此基礎上，設計并構建Exo Ⅲ輔助的靶目標多重循環利用策略，可進一步提高Hg2+檢測的靈敏度。

作為一種重要的酶促信號放大方法，DNA酶催化技術由于具有成本低、操作簡單、檢測快速等優點，在生物分析和生物傳感領域引起了廣泛關注[22]。具有類過氧化物酶活性的G-四鏈體-血紅素DNA酶是近年來該領域研究的熱點之一，已被廣泛用于高靈敏傳感器的構建，并用于病毒[23]、金屬離子[24]、小分子[25]等的檢測。

本研究利用Exo Ⅲ輔助的靶目標循環利用信號放大、Hg2+觸發的核酸探針末端結合以及G-四鏈體-血紅素DNA酶的催化信號放大的技術優勢，設計并構建一種免標記、超靈敏的雙發夾探針介導的雙循環信號放大體系， 用于Hg2+比色傳感。此體系整合3種信號放大技術：Exo Ⅲ輔助的Hg2+循環利用（循環1）、Exo Ⅲ輔助的Ⅰ區序列循環利用（循環2）以及基于DNA酶的催化信號放大。本方法具有簡單方便、成本低、靈敏度高、特異性好等優點，可用于現場檢測自來水、湖水、河水等水體中的Hg2+含量。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

UV-1800型紫外-可見分光光度計（日本島津公司）; 7700X型電感耦合等離子體質譜（安捷倫公司）; THZ-C-1 臺式冷凍恒溫搖床（太倉市實驗設備廠）; ?Milli-Q Reference 超純水器（德國默克密理博公司）; 高速離心機（艾本德生命科學公司）; pH-2602 酸度計（杭州陸恒生物科技有限公司）; 電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）; DH300恒溫金屬浴（杭州瑞誠儀器有限公司）。

氯化血紅素（Hemin）、2，2'-聯氮基-雙-（3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（ABTS）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、二甲亞砜（DMSO）、HgCl2、Pb（NO）2、CdCl2、FeCl3及其它金屬離子溶液均購自上海生工生物工程股份有限公司。所用試劑均為分析純，且未經過進一步純化。實驗用水為超純去離子水。

DNA探針由上海生工生物工程股份有限公司合成，序列信息見表1。

2.2?實驗方法

2.2.1?發夾探針的制備?發夾探針1、發夾探針2及汞離子識別探針用20 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 7.4，包含70 mmol/L NaCl，10 mmol/L MgCl2，20 mmol/L KCl）配制。為了減少非發夾二聚體的產生，并提高發夾結構的形成比例，采用逐步緩慢退火方法。將發夾探針1（0.5 μmol/L）和發夾探針2（0.5 μmol/L）于冰上溶解，隨后90℃孵育10 min，70℃孵育10 min，50℃孵育30 min，30℃孵育10 min，最后于室溫放置30 min。

2.2.2?Hg2+比色分析?移取25 μL發夾探針1（0.5 μmol/L）、25 μL發夾探針2（0.5 μmol/L）和25 μL 汞離子識別探針（0.2 μmol/L）于滅菌離心管中，加入0.5 μL Exo Ⅲ （20 U/μL）和25 μL不同濃度的Hg2+溶液，25℃孵育60 min ，再加熱到80℃，保溫10 min，滅活Exo Ⅲ。加入0.5 μL 0.4 μmol/L Hemin，避光下37℃孵育60 min。移取10 μL上述溶液，加入45 μL ABTS（4 mmol/L）和45 μL H2O2 （4 mmol/L），37℃反應8 min。選擇420 nm處的吸光度作為測量值，定義ΔA420 nm=A420 nm-A0，其中，A420 nm為樣品測量值，A0為Hg2+濃度為0時的背景值。

3?結果與討論

3.1?檢測原理

本研究設計了2個具有特定序列的發夾探針，借助T-Hg2+-T結構形成的特異性、Exo Ⅲ輔助的靶目標循環利用以及G-四鏈體-血紅素DNA酶的催化信號放大性能，構建了一種基于Hg2+引發和Exo Ⅲ輔助的靶目標雙循環回收利用信號放大技術，用于Hg2+比色傳感。G-四鏈體的形成至少需要4組連續或相互靠近的GGG序列，發夾探針1和發夾探針2的序列都含有4組GGG重復序列，但由于2個探針在形成莖環結構時都有2組GGG被包含在莖部區域，因此不能形成分子內G-四鏈體。如圖1所示，在發夾探針1、發夾探針2、汞離子識別探針及Hg2+存在時，汞離子識別探針的5'端序列與發夾探針1的3'末端單鏈游離序列（富含T堿基）通過形成2個T-Hg2+-T特異性配位結構相互雜交，并在發夾探針1的3'末端形成了雙鏈DNA平齊末端，此時，汞離子識別探針的3'端設計為游離末端，不能被Exo Ⅲ切割。 在這種情況下，Exo Ⅲ能識別雙鏈DNA平末端并沿3'-?5'方向催化水解發夾探針1的莖部序列，釋放出單核苷酸、Hg2+、汞離子識別探針及發夾探針1未降解序列。釋放的Hg2+和汞離子識別探針可引發新一輪發夾探針1的Exo Ⅲ切割反應，由此形成反應循環（循環1）; 釋放的發夾探針1未降解序列中包含的5'莖部序列（Ⅰ區序列），可與發夾探針2的3'末端單鏈游離序列（Ⅰ區序列）完全互補，形成雙鏈DNA平齊末端，引發Exo Ⅲ參與的雙鏈DNA平末端切割，水解發夾探針2的莖部序列，釋放出Ⅰ區序列進入新一輪反應循環（循環2）。循環1和2為自發循環過程，經過多次循環可以產生大量單鏈的G-四鏈體序列。在體系中加入氯化血紅素，與G-四鏈體結合形成G-四鏈體-血紅素-DNA酶，催化ABTS-H2O2反應體系顯色。由于G-四鏈體-血紅素-DNA酶的量與吸光度呈正相關，設計的Exo Ⅲ輔助雙循環靶標回收利用策略能夠顯著放大檢測信號。

3.2?實驗條件的優化

考察了影響雙發夾探針雙循環等溫信號放大系統分析性能的實驗條件對檢測的影響，包括T-T錯配數目、Exo Ⅲ催化反應溫度及時間、Exo Ⅲ濃度。

3.2.1?T-T錯配數目的選擇?發夾探針1的3'端游離序列與汞離子識別探針之間可通過T-Hg2+-T錯配互補結合，其T-T錯配數目對Hg2+檢測系統的性能非常重要。設計了4種汞離子識別探針，分別能夠形成1～4個T-T錯配。結果如圖2A所示，在Hg2+存在情況下，末端存在2個T-T錯配的識別體系表現出較高的吸光值。因此，后續選擇汞離子識別探針2，在Hg2+存在時，此探針能夠高效誘導雙鏈平末端形成，并激活Exo Ⅲ輔助的雙循環目標再利用信號放大，用于Hg2+含量分析。

3.2.2?Exo Ⅲ催化反應溫度的選擇?考察了不同的Exo Ⅲ反應溫度（10～35 ℃）對Hg2+比色傳感體系信號的影響。如圖2B所示，在10～25℃范圍內，隨著反應溫度升高，反應體系ΔA420 nm增加; 但在25～35℃范圍內，隨著溫度升高，吸光值反而降低。這是由于反應溫度較高時，汞離子識別探針較短，不能穩定地與發夾探針1的3'游離序列雜交，Exo Ⅲ與之結合不穩定，導致催化活性降低; 另外，反應溫度較高時，發夾探針1和2的莖部序列結合不穩定，直接打開后可形成分子內G-四鏈體，背景信號升高 （在沒有Hg2+的情況下）。為了獲得最佳檢測信號（ΔA420 nm），后續實驗的反應溫度采用25℃。

3.2.3?Exo Ⅲ催化反應時間的選擇?Exo Ⅲ的催化反應時間對信號放大有較大影響。如圖2C所示，隨著反應時間延長，ΔA420 nm不斷增加，孵育60 min后，信號達到穩定，隨后開始下降，這主要是背景信號逐漸升高導致的。因此，催化反應時間選擇60 min。

3.2.4?Exo Ⅲ濃度的選擇?Exo Ⅲ的工作濃度對于信號放大系統非常關鍵。體系響應信號隨Exo Ⅲ濃度的增加而增大，在10 U Exo Ⅲ時達到最大值; 隨著Exo Ⅲ濃度進一步升高，響應信號反而下降。這是由于反應體系中無論Hg2+是否存在，高濃度的Exo Ⅲ會不可控地切割DNA探針，從而導致背景信號升高。因此，Exo Ⅲ的最佳工作濃度為10 U。

綜上，選擇Hg2+引發的末端結合位點存在2個T-T錯配位點、Exo Ⅲ催化溫度25℃、Exo Ⅲ孵育時間60 min和10 U 的Exo Ⅲ工作濃度為最佳實驗條件。

3.3?Hg2+的選擇性分析

考察了不同離子（Zn2+、Pb2+、Cu2+、Ni2+、Fe3+、Cd2+、Ca2+、Mn2+、Co2+）對檢測體系響應信號的影響。結果如圖3所示，在最優實驗條件下，空白對照（未加入任何干擾離子）的吸光值與分別加入單一不同種類干擾離子的反應體系吸光值相近（黑色柱狀圖），說明以上離子對此傳感體系無顯著影響; 考察了Hg2+與其它金屬離子共存時的信號值變化情況，向反應體系中同時加入100 pmol/L的Hg2+和上述10 nmol/L干擾離子，結果顯示，各共存反應體系的吸光值與空白對照吸光值相差不大（白色柱狀圖），相對誤差在1.5%～3.1%之間，證明以上幾種金屬離子對Hg2+檢測的干擾很小，設計的生物傳感器對Hg2+具有高的選擇性。

3.4?Hg2+的定量檢測

在最優實驗條件下，采用本方法測定了不同濃度的Hg2+標準液的響應信號。由圖4A可知，隨著Hg2+濃度的增大，反應體系在420 nm的吸光值不斷升高，。Hg2+濃度在0.3～50 pmol/L之間呈現良好的線性關系（圖4B），回歸方程為ΔA420 nm=0.117+0.004CHg2+（R2=0.992）， 檢出限為0.25 pmol/L（3σ），遠低于我國《生活飲用水衛生標準》規定的飲用水中無機Hg2+的最高允許水平（<5 nmol/L，1 ppb）。

結果表明，本方法對Hg2+的定量分析具有較高的靈敏度和良好的線性度。

早期傳統的比色傳感系統由于缺乏有效的信號放大方法，只能識別nmol/L級的Hg2+ [15，26]。近年來建立的DNA探針介導Exo Ⅲ輔助的單循環靶標（Hg2+）回收利用策略，可以實現pmol/L水平的Hg2+檢測 [20，21]，上述方法僅僅使用了一個信號放大循環（Exo Ⅲ輔助Hg2+循環利用）。與現有的Hg2+含量分析方法相比（表2），本方法具有良好的檢測性能，這主要歸因于三重信號提升方式： Exo Ⅲ輔助Hg2+循環利用、Exo Ⅲ輔助Ⅰ區序列循環利用以及G-四鏈體-血紅素DNA酶的酶促催化信號放大。

3.5?實際樣品分析

分別采集湘江水、自來水以及湖水樣品，使用前過濾去除懸浮顆粒及雜質。各樣品中分別添加0.5、 5.0、 50.0和100.0 pmol/L Hg2+。采用本方法進行測定，檢測結果如表3所示，3種不同來源水體樣品的加標回收率在96.0%～106.0%之間。采用電感耦合等離子體質譜（ICP-MS）測定了水體樣品中的Hg2+濃度，使用的ICP-MS方法由于靈敏度的限制，能夠準確定量的Hg2+添加濃度為50.0 pmol/L和100.0 pmol/L，其結果與本方法檢測結果的相對誤差為5.3%～6.0%。結果表明， ICP-MS測定值與本方法的測定值沒有顯著差異，說明本方法具有良好的準確度和靈敏度，能夠滿足環境水體中 Hg2+檢測的要求。

4?結 論

基于Hg2+觸發的核酸探針末端結合、核酸外切酶Ⅲ輔助的靶目標雙循環再利用信號放大以及G-四鏈體-血紅素DNA酶酶促催化信號放大，設計并構建了一種免標記、超靈敏的雙發夾探針介導的靶目標雙循環等溫信號放大新技術， 用于Hg2+的比色傳感。本方法操作簡單、靈敏度高、特異性好，對環境水體樣品具有良好的檢測性能，可用于環境檢測領域現場分析技術的開發。

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