固相支撐液液萃取-液相色譜-串聯質譜法測定尿液中10種單羥基多環芳烴

商婷 趙靈娟 李佩 曾祥英 于志強

摘?要?通過檢測人體尿液中多種羥基多環芳烴（OH-PAHs）的濃度可全面評估多環芳烴（PAHs）在人體的負荷水平。本研究建立并優化了一種基于固相支撐液液萃取（SLE）的前處理技術，在此基礎上，利用液相色譜-串聯質譜法（LC-MS/MS）測定人體尿液中的10種OH-PAHs。尿樣采用硅藻土SLE柱進行富集凈化，二氯甲烷-正己烷（3∶7， V/V）混合溶液作為目標化合物的洗脫液。前處理優化結果表明，與傳統方法相比，本方法具有較好的回收率，同時可有效降低生物基質的干擾。本方法在3個加標濃度水平（10、50和100 μg/L）下的回收率為88.5%～120.9%，重復性精密度范圍為1.6%～8.1%。檢出限與定量限分別在0.06～0.3 μg/L和0.2～1.0 μg/L之間。本方法成功用于廣東省小學生尿液中OH-PAHs的測定， 結果表明，2-OHN是最主要的檢出化合物，最高濃度達到4.83 μg/L。

關鍵詞?單羥基多環芳烴; 尿液; 固相支撐液液萃取; 液相色譜-串聯質譜

1?引 言

多環芳烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是指分子中具有兩個或兩個以上苯環的一類碳氫化合物，其主要來源是煤、石油、木材等不完全燃燒或熱裂解產物[1]。PAHs可通過呼吸道、皮膚和消化道等多種暴露途徑進入人體，經體內代謝形成羥基多環芳烴（OH-PAHs），并以葡萄糖醛酸、硫磺酸結合物的形式主要通過尿液排泄[2]。由于它們具有潛在的“三致”（致癌、致畸、致突變）效應以及在全球分布的廣泛性[3]，PAH對人體健康的潛在危害成為世界各國廣泛關注的環境污染問題，人體內暴露水平的評估是開展PAHs健康風險評價的重要基礎科學數據。

已有研究顯示，尿中PAHs代謝物的測定通常與PAHs暴露密切相關[4]。由2～4個苯環組成的分子量較小的OH-PAHs，主要通過尿液排泄，而分子量較高的OH-PAHs（苯環數量>4）主要通過糞便排泄[5，6]。由于PAHs的暴露途徑復雜多變，各種暴露途徑對人體內暴露的貢獻難以準確評估，因此，人體尿液中OH-PAH的測定成為評價PAH內暴露水平的重要生物標志物。目前，固相萃取（SPE）[6～11]與液液萃取（LLE）[12～17]是應用最廣泛的樣品前處理方法。SPE具有重現性穩定以及裝置價格合理、易于獲取等特點，但樣品前處理使用相應的萃取柱時需活化、平衡和清洗等步驟，耗時耗力。LLE常用溶劑有戊烷、二氯甲烷和正己烷等，選擇性高，分離效果較好，但操作復雜，溶劑使用量大，且易產生乳化現象導致重復性較差，且上述前處理技術存在目標化合物回收率不穩定、生物基質干擾嚴重等技術難點，無法滿足流行病學大樣本量研究的需求，因此，開發快速、高效的前處理技術成為OH-PAHs內暴露研究的重要內容。

SLE柱采用了特殊工藝處理過的硅藻土，擁有最大的比表面積和最低的表面活性，能提供一個理想的液液分配的支撐表面，可代替大部分傳統的LLE方法[18]。在傳統LLE方法基礎上，SLE方法利用分析物在兩相中不同的溶解度和分配比，采用經過高度改良的具有高比表面積的多孔硅藻土作為吸附劑，結合其吸水性強、化學惰性等特點，快速附樣品基質中的水分，使目標物與水分分離，具有不易產生乳化現象、基質效應降低和需要樣品量少等優點[19]。樣品前處理時，使用相應的萃取柱，僅需上樣和洗脫兩步，即可從水相中萃取目標化合物。當加入水性生物樣品時，樣品在填料的表面擴散并被吸收，從而形成萃取界面，相當于LLE的界面，當與水不相溶的有機溶劑加入后，目標分析物被有機溶劑溶解并收集下來。相較于LLE、SPE等傳統尿液前處理方法，SLE可有效提高樣品的提取能力和效率，已廣泛應用于人體尿液和血液樣品的前處理[20～28]，如Meunier等[28]用甲基叔丁基醚提取血漿樣品的醛固酮，方法方便簡單。Liu等[23]利用正己烷萃取人體血液和尿液中的多環麝香，無需調節pH值和鹽度，樣品制備時間顯著縮短（～15 min）。上述研究結果表明，利用SLE方法可以對生物體液中的污染物進行高通量分析。

本研究選擇人尿液中的1-羥基萘（1-OHN）、2-羥基萘（2-OHN）、2-羥基芴（2-OHF）、3-羥基芴（3-OHF）、1-羥基菲（1-OHPhe）、2-羥基菲（2-OHPhe）、3-羥基菲（3-OHPhe）、4-羥基菲（4-OHPhe）、9-羥基菲（9-OHPhe）和1-羥基芘（1-OHP）共10種OH-PAHs為目標物，通過SLE洗脫溶劑的篩選和優化，確定前處理富集凈化方法，然后使用LC-MS/MS 技術對其進行定性和定量分析，為尿液中常見的PAHs代謝產物檢測提供了科學依據。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

1100型液相色譜儀（LC，美國Agilent公司）-API4000三重四極桿質譜儀（MS/MS，美國AB SCIEX公司）; HeraeusTM LabofugeTM200臺式離心機（美國Thermo Fisher公司）; 氮吹儀（美國Pierce公司）; 12孔固相萃取裝置（美國Supeclo公司）; Milli-Q Unique-R10超純水系統（美國Millipore公司）; 0.2 μm聚四氟乙烯膜濾頭（上海安譜科學儀器有限公司）; 5-mL SLE固相支撐液液萃取小柱（瑞典Biotage公司）。

正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲基叔丁基醚、正戊烷、甲苯和甲醇等有機溶劑均為色譜級（99.9%，德國Merck公司）; 醋酸鈉和冰醋酸 （99.97%，美國Tedia公司）; HCl（質量分數為37%，德國 Sigma-Aldrich 公司）; β-葡萄糖苷酸-芳基硫酸酯酶（美國Sigma公司，含122400單位/mL β-葡糖苷酸酯酶和3610 單位/mL芳基硫酸酯酶）; 實驗用水為超純水（18.2 MΩ·cm）。

10種OH-PAHs標樣（1-OHN、2-OHN、2-OHF、3-OHF、1-OHPhe、2-OHPhe、3-OHPhe、4-OHPhe、9-OHPhe和1-OHP）均購于美國Supelco公司; 同位素標記的標樣（D8-1-OHN和D9-1-OHP）來自美國劍橋同位素實驗室。

2.2?尿液樣品采集

尿液樣本的采集對象為廣州市某小學四年級學生，所有志愿者均自愿參加，并在家長的引導下簽署同意書，本研究隨機選取了20例尿液樣本進行檢測，對方法應用進行驗證。尿液樣本采集后保存于預先處理過的聚乙烯塑料瓶中，于80℃放置備用。

隨機采取實驗室志愿者（22～28歲）尿液10例，每例取10 mL進行混合，形成的混合尿液基質用于方法優化。

2.3?樣品前處理

樣品置于室溫下解凍后，3000 r/min離心10 min，取上清液，準確量取2 mL，加入10 ng回收率指示物（D8-1-OHN和D9-1-OHP），加1 mol/L HCl溶液與醋酸-醋酸鈉緩沖溶液調節樣品至pH 5.0，加β-葡萄糖苷酸-芳基硫酸酯酶20 μL，充分混勻，置于恒溫振蕩器中于37 ℃下避光酶解16 h。將酶解后的樣品加入固相支撐液液萃取小柱中，施加2～10 s的真空或正壓，等待5 min，使樣品分散并充分吸附于填料表面。以5 mL二氯甲烷-正己烷（3∶7， V/V）混合溶液作為洗脫溶劑，連續洗脫3次，合并收集到的洗脫液進行氮吹，以甲醇定容至400 μL。用0.2 μm的尼龍膜過濾后，于20℃保存， 備用。

2.4?儀器分析

采用Eclipse-C18柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm， 美國Agilent公司）為色譜分析柱， 進樣量為10 μL， 以水（A）和甲醇（B）為流動相， 流速為0.6 mL/min， 梯度洗脫程序： 0～5 min， 60% B; 5～14 min， 60%～78% B; 14～21 min， 78%～85% B; 21～30 min， 85%～100% B; 30～35 min， 100% B; 35～39 min， 100%～60% B; 39～45 min， 60% B。質譜檢測采用電噴霧離子源（ESI）， 負離子模式， 電壓4500 V， 離子源溫度450℃， 霧化氣壓力50 psi， 輔助氣壓力60 psi， 窗簾氣壓力30 psi; 采用多反應監測模式（MRM）。各目標化合物保留時間和定性定量離子對見表1。

3?結果與討論

3.1?洗脫溶劑的優化

用于SLE柱的洗脫溶劑需與水不混溶，同時對OH-PAH具有良好的溶解性，因此溶劑的選擇主要取決于目標物的溶解度和極性等特性。對于非極性化合物，非極性溶劑（如庚烷、戊烷、己烷）較為理想，而弱極性化合物，需選擇有一定極性的有機溶劑，如甲基叔丁基醚、二氯甲烷或乙酸乙酯。目標OH-PAHs的pKa值在8.0～9.2之間，具有弱極性。基于此，選取正己烷（Hex）、甲苯（MB）、戊烷（Pen）、二氯甲烷（DCM）、乙酸乙酯（EtAC）、甲基叔丁基醚（MTBE）作為洗脫溶劑進行優化，通過10種OH-PAHs的回收率進行評價。

不同溶劑體系對10種OH-PAHs回收率的影響如圖1所示，每種溶劑對OH-PAHs都有一定洗脫效率，其中DCM對各目標化合物的回收率均較理想。但由于DCM極性強，洗脫能力隨之增強，因此洗脫下來的化合物相對較多，在LC-MS/MS進樣時發現具有較多的非目標化合物被檢測到，因此本研究中進一步考慮采用Hex-DCM混合體系，并對Hex-DCM不同配比時的混合溶劑的洗脫能力進行考察。結果表明，當洗脫溶劑Hex-DCM的配比為7∶3（V/V）時，所有目標物的回收率均理想，且色譜峰的干擾較小; 當DCM配比增加時，回收率無明顯提高而干擾峰增加。最終選擇DCM-Hex（3∶7， V/V）混合溶劑作為洗脫溶劑。

對洗脫溶劑的使用量進行了優化。洗脫溶劑使用量對回收率的影響見圖2， 采用1 × 5 mL混合溶劑洗脫目標化合物，除1-OHP外，其余化合物回收率均高于90%， 使用3×5 mL混合溶劑時10種OH-PAHs的回收率均高于95.0%。因此洗脫次數最終設定為3次，優化的洗脫液的體積為15 mL。

3.2?方法評價

尿液基質為10例志愿者尿液的等體積混合液。采用標準加入法考察本方法的回收率，由于混合尿液基質中廣泛存在OH-PAHs，因此同時進行加標基質和空白基質的前處理，每個加標濃度進行6次重復實驗。從回收率、重復性及基質效應等3方面對建立的方法進行評價，并與目前廣泛使用的固相萃取方法進行對比。

評價方法中分別進行低濃度（10 μg/L）、中濃度（50 μg/L）和高濃度（100 μg/L）的加標實驗，同時依據文獻[11]中的報道，通過手動SPE裝置、全自動SPE裝置流程進行尿液前處理，以便進行比對。不同方法中目標化合物的回收率見表2。結果表明，SLE前處理方法中，各目標化合物在10、50與100 μg/L加標濃度下的回收率在88.5%～120.9%之間，相對標準偏差<6.7%; 手動SPE的回收率在804%～940%之間，自動SPE的回收率在76.8%～107.3%之間。 與手動SPE、自動SPE相比，本方法加標回收率更高，穩定性也較好。

通過混合尿液基質加標與溶劑標樣同時檢測，基質效應計算公式如下：

其中， ME為基質效應; Area1為混合基質加標后目標物檢測的響應峰面積; Area0為混合基質中目標物檢測的響應峰面積; Area2為溶劑標樣中目標物檢測的響應峰面積。ME<0，表示有基質抑制效應; ME>0，表示有基質促進效應; ME=0，表示無基質效應。結果表明（表3），SLE各化合物的基質效應在4.1%之間，均呈現基質抑制效應，但除了2+3-OHF與1+9-OHPhe外，基質效應均較小。與手動SPE的44.2%～21.6%和自動SPE的74.9% ～39.1%相比，基質效應明顯降低。引起LC-MS/MS中基質效應的內源性成分（如鹽、蛋白質、肽類和磷脂等）在這些溶劑中不可溶。因此，分析物被洗脫下來，而基質仍保留在硅藻土吸附劑的水相中，被有效地從最終萃取物中去除。

表4列出了所有分析物的回歸方程、重復性、檢測限和定量限。各化合物都呈現了良好的線性，相關系數（R2）均高于0.993。檢出限與定量限分別在0.06～0.3 μg/L和0.2～1.0 μg/L之間，各化合物的日內（n=6）偏差與日間（n=6）偏差在1.6%～8.1%之間。OH-PAHS標準物的總離子流圖見圖3。

目前，用于OH-PAHs的檢測方法主要有HPLC、GC-MS和LC-MS/MS。方法的回收率和靈敏度除儀器自身的檢測能力外，前處理過程也在很大程度上影響分析方法的回收率及靈敏度。Jongeneelen等[29]采用SPE對尿樣中1-OHP進行富集，回收率僅為 78%±2%，尿樣基質干擾大。Campo等[12]用正己烷進行LLE萃取，在此基礎上通過甲硅烷基化試劑進行衍生化，GC-MS方法檢測的LOD在0.1～1.4 μg/L之間。Jacob等[14]采用戊烷-乙酸乙酯（9∶1， V/V）混合溶劑萃取出尿液樣品中的OH-PAHs，隨之將代謝物轉化為五氟芐基醚衍生物后， 利用LC-MS/MS進行檢測， 方法靈敏度高，LOD可低至0.01～0.50 μg/L。但這些方法需要進行分析物的衍生化，操作繁瑣耗時，衍生化反應的穩定性要求較高。Fan等[13]建立了一種利用戊烷和甲苯的混合溶劑萃取OH-PAHs的方法，減少了基質干擾并顯著提高了方法靈敏度，LOD范圍為1.72～17.47 ng/L，但需要加入AgNO3溶液以降低PAH硫化物的干擾，操作相對較為復雜，不適用于流行病學大隊列的研究需求。本方法與文獻報道的其它方法相比，不需要進行衍生化，操作簡單快速，且檢出限較低。

3.3?方法的實際應用

應用本方法對廣東省某小學志愿者的20例尿樣進行了檢測。由表5可見，所有目標物均有檢出，2-OHN是最主要的檢出化合物，最高濃度達到4.83 μg/L。目標物的平均濃度分別為2-OHN 1.16 μg/L、1-OHN 0.62 μg/L、2+3-OHF 0.21 μg/L、2-OHPhe 0.08 μg/L、3-OHPhe 0.11 μg/L、1+9-OHPhe 0.10 μg/L、4-OHPhe 0.02 μg/L和1-OHP 0.15 μg/L。上述結果表明，本方法可用于人體尿液中OH-PAHs的檢測。

4?結 論

建立了SLE富集、凈化人體尿液中多種 OH-PAHs， 結合LC-MS/MS進行檢測的方法。 建立的前處理技術無需對SLE柱進行預活化，只需將2 mL尿液樣品酶解后載入柱中，用3×5 mL二氯甲烷和正己烷（3∶7，V/V）的混合溶劑進行洗脫，方法簡單、快速。與目前廣泛使用的SPE等前處理技術相比，SLE方法具有回收率高且穩定、生物基質干擾較小等顯著優勢，可滿足人體尿液中10種OH-PAHs的分析需求。

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