微液滴生成方法研究進展

魏玉瑤 孫子喬 任昊慧 李雷

摘?要?微液滴在生物、化學、材料科學、工程等領域的應用十分廣泛， 液滴的生成方法越來越高效可控。從傳統的制備微液滴的方法， 到微流控芯片方法， 再到近幾年新出現的一些芯片外方法， 微液滴的制備技術在數十年間不斷發展和完善。本文首先簡要回顧了制備微液滴的幾種典型的傳統方法和微流控芯片方法， 重點介紹了一些近年來發展的新方法的原理、設備和應用， 對這些方法的特點進行了總結， 并對微液滴技術的未來發展提出了展望。

關鍵詞?微液滴; 液滴微流控; 液滴生成; 評述

1?引 言

微液滴在生物、化學、材料科學、工程等領域的應用十分廣泛， 如目前已經商業化的微滴式數字PCR系統[1，2]、以微液滴作為微反應器對化學物質進行檢測和篩選的液滴微流控系統[3，4]以及以液滴為基本單位制備新型環保無害材料[5，6]等。在Web of Science 網站以“micro droplet”作為關鍵詞進行檢索， 可以發現， 相關論文發表數量在過去20年里持續增長， 尤其是在2002年之后， 研究成果量增長迅速（圖1）。

傳統的微液滴制備方法至今仍在廣泛使用。隨著液滴應用范圍的拓展， 人們對液滴的產生速度、液滴尺寸、液滴生成系統的實用性等方面提出了更高的要求， 多種能夠快速生成液滴、液滴大小可控、操作簡便的新方法應運而生。其中， 微流控芯片是目前生成微液滴的主要工具， 它具有體積小、生成液滴速度快、液滴大小均勻、體系封閉以及單分散性良好等優勢。基于微流控芯片的液滴平臺在藥物篩選、細胞研究以及DNA和蛋白質等生物大分子的分析檢測等方面有著廣泛的應用[7，8]。

除微流控芯片外， 近年還出現了一些其它類型的液滴制備方法， 如界面打印液滴生成法[9]、利用旋轉的毛細管生成液滴的方法[10]、液滴裂分法[11]等。這些方法避免了專業的芯片設計與加工以及對專業操作人員的依賴， 為能夠更加方便快捷地生成微液滴提供了更多的可能。

本文簡要回顧了制備微液滴的典型的傳統方法和基于微流控芯片的方法， 重點介紹了近幾年提出的新方法， 對這些方法的原理和特點進行總結， 希望能夠為研究者選擇適合的微液滴制備方法提供啟示， 最后對微液滴技術的未來發展進行了展望。

2?液滴生成方法

早期使用的生成液滴方法主要有高速攪拌法[12，13]、逐層組裝技術[14～16]、膜乳化法[17～19]和界面聚合法[20～23]等， 均可生成微納米尺寸的液滴。高速攪拌法工序少、操作簡單、成本低; 逐層組裝技術通用性和可控性強， 可用于構建藥物控釋系統， 靈活控制遞藥載體結構[24]; 膜乳化法制備的高分子微球廣泛應用于化妝品、醫藥、化工、電子等領域; 界面聚合法設備簡單， 不要求嚴格的聚合物量比， 主要應用于新型材料的制備。這些方法至今仍在其各自適合的領域發揮作用， 但在液滴穩定性、均勻性、單分散性等方面仍存在不足。近年來， 研究者在致力于傳統方法的設備更新、技術改進的同時， 也發展出多種不同原理的新方法。

微流控芯片作為一類制備微液滴的平臺， 生成的液滴尺寸可控、擴散性低、生成速度快、不易交叉污染， 適合進行高通量分析[25，26]。根據是否借助外力驅動， 基于微流控芯片的液滴生成方法一般可分為主動法和被動法兩類。主動法常用方式包括電濕潤法（Electro wetting on dielectric， EWOD）[27～31]、氣動法（Pneumatic pressure）[32，33]、熱驅動法（Thermal method）[34，35]等， 其原理是借助外力作用在液體兩端產生壓差， 并利用液體在微流道交叉口處的剪切力和表面張力差形成液滴。被動法利用流體流動的剪切力和界面張力， 通過微管道結構及調節連續相和分散相的流速值及比例來生成液滴， 主要包括T型通道法（Tjunction）[36～38]、流動聚焦法（Flowfocusing）[39～41]和共軸聚焦法（Coaxial flow）[42～44]等芯片結構形式。其中，T型通道法芯片只有兩個入口， 是液滴微流控芯片中最簡單的結構。流動聚焦法的十字交叉結構可視為是兩個T型結構的結合， 中間通道為連續相流體， 兩側通道為分散相流體。主動法系統相對復雜， 對芯片加工的要求較高， 增加了實驗的難度及成本， 但主動法可根據需要對單個液滴進行控制， 在液滴的可操控性方面存在很大優勢。被動法系統相對簡單， 操作方便， 適合單純需要快速生成大量液滴的情況。除上述的微液滴制備方法外， 近年來涌現出了許多獨具特色的新方法。本文將重點介紹這些新方法的原理、特征及應用。

2.1?一次過程生成多個液滴的方法

2.1.1?滑動芯片?Ismagilov實驗室[45]發明了一種滑動芯片（SlipChip）裝置（圖2A）， 可用于多路情況下的各種生化反應，而不依賴于泵和閥門。該裝置由上下兩塊緊密接觸的玻璃板構成， 底板上具有微孔陣列及微管道， 頂板上具有與底板相對應的微孔陣列。當頂板微孔與底板微管道對齊時， 該結構連接成一條連續的流體通道。實驗時， 在底板微孔中預先加入試劑， 蓋上頂板， 形成流體通道， 向通道中注入樣品， 之后滑動芯片使兩塊板的微孔對齊， 液滴混合， 發生反應。SlipChip具有消耗試劑少、 不易交叉污染、 多路反應可同時進行等優點。已有研究將滑動芯片法應用于稀有細胞的篩選和分析， 并提出了微流體的隨機限制（Microfluidic stochastic confinement）的概念， 該工作將有助于拓展微流體隨機限制在人類疾病診斷和環境測試等領域的應用前景[46]。滑動芯片法在單細胞遺傳分析的所有階段亦有廣闊的應用前景， 包括細胞富集和捕獲、單細胞劃分和操作以及檢測和分析[47]。通過滑動芯片法還能控制液滴形狀和體積， 在一個液滴中生長出一個晶體， 進而實現蛋白質單晶體的制備[48]。另外， 滑動芯片法在生物分析傳感器的亞皮摩爾檢測極限解決方案方面亦有應用[49]。在合成其它難以獲得的新功能材料和結構， 如研究脂質和聚合物膜的功能和性質， 以及在液液界面上執行反應等過程研究方面， 滑動芯片法也有所進展[50]。有研究者研發出基于滑動芯片法的全自動、低成本和手持的數字PCR平臺[51]， 并有望應用于恒溫核酸擴增方法等生物監測領域[52]。如將滑動芯片法與其它微流體技術整合， 可進行大范圍的重復樣品生物分析工作[53]， 包括快速識別血液等復雜生理基質中的病原體[54]、單分子核酸分析[55]。在SlipChip的基礎上， 發展出了一種新的可拓展性平臺， 利用溶液的表面張力實現流體輸送、混合、維持計量體積以及生物分子捕獲和釋放等[56]。但是， 由于采用了加工成本相對高的玻璃材質制作芯片， SlipChip方法可能導致費用增加;

另外， SlipChip方法比較適合進行一些特定的生化反應， 單獨作為液滴制備方法使用并不能體現該方法的優勢。

2.1.2?液滴裂分法制備飛升級液滴?Li等[11]提出了一種制備體積在飛升級的液滴的方法（圖2B）， 可將液滴分裂成均勻的小體積的微液滴陣列。該方法通過在帶有親水性區域的疏水性硅板上滑動液滴， 實現pL～fL級均勻微液滴的可控制備。系統地討論了影響產生的微液滴體積的關鍵因素， 包括親水性區域大小、接觸力以及液滴與疏水硅板之間的相對滑動速度。該方法能提供高通量且體積均勻的微液滴， 具有簡便、高效、低成本的優勢， 適合應用于細胞分析， 特別是生成單細胞陣列; 此外， 這種方法也被用于構建應用在微重力環境下的生物傳感平臺， 并實現了對葡萄糖、鈣和蛋白質等典型標志物的檢測[58]。Guo等[59]利用表面潤濕性方法實現了對化學和生物分子的超靈敏檢測， 有望進一步用于分析化學、分子診斷和環境監測等領域。體積在fL級別的液滴陣列是光操作、傳感和高通量診斷等技術中重要的影響因素[60]， 已有液滴體積可調的二維液滴陣列應用于多體積數字PCR[61]。另一方面， fL級液滴制備方法能夠在有機溶劑中實現小型化和平行的高通量篩選[62]， 并已被用于光子操縱的可調節納米透鏡陣列[63]。

2.1.3?基于界面瑞利泰勒不穩定性的液滴生成法?Marthelot等[57]從涂料容器的蓋子上粘附涂料的現象受到啟發， 利用液膜的不穩定性生成下墜液滴（圖2C）。作者在一個圓盤上傾倒一薄層硅膠液膜， 在液膜固化的同時反轉圓盤， 倒置幾分鐘后， 在重力和表面張力的共同作用下， 液體硅膠會自然形成不規則的下墜狀液滴陣列。通過使用離心機還可以在一定范圍內改變液滴大小， 旋轉的速度越快， 生成的液滴越小。這種方法巧妙地將通常需要克服的界面不穩定性這一缺點轉變為一種可以大規模生成微液滴陣列的途徑， 對環境和設備的要求也很低， 在柔性仿生結構制備方面具有應用前景。但由于材料需經歷由液態轉變為固態的過程， 目前只使用了硅橡膠作為實驗對象， 基于其它材料（如蠟、熔融玻璃、金屬等）的結構制備還需要進一步研發。

2.2?一次過程生成一個液滴的方法類型

2.2.1?順序操作液滴陣列系統?浙江大學方群課題組[64]提出了順序操作液滴陣列（Sequential operation droplet array， SODA）系統（圖3A）， 可自動完成對超微量（pL～nL）液滴的多步操控。第一代SODA儀器由注射泵、毛細管探針、承載樣品的芯片和孔板以及一個可以在xyz方向移動的平臺組成。在此基礎上， 第二代SODA儀器增加了CCD成像系統和探針的自動定位程序， 并將注射泵集成到儀器中。SODA系統可實現液滴的定量、液滴陣列的生成、液滴的定位與移動、液滴的分裂（取樣）與融合（加入試劑）等操作， 已被成功應用于高通量藥物篩選[65～67]、蛋白質結晶條件的篩選[68，69]、數字PCR[70]、單細胞分析[71]、細胞遷移[72]、細胞共培養[73]等研究中， 并實現了與電噴霧質譜（ESIMS）[74]、高速毛細管電泳[75，76]和色譜[77]等系統的分析聯用。

2.2.2?界面打印液滴生成法?Xu等[9]提出了一種界面打印液滴生成法（Crossinterface emulsification， XiE）， 利用毛細管連續輸出水相， 并在油氣界面處高頻振動， 以及油氣界面表面張力的周期性切割作用， 可連續快速生成大量pL～nL級體積可控的單分散液滴（圖3B）。XiE無需借助微加工技術， 只需要一臺注射泵和一臺控制毛細管按固定頻率振動的電磁振動器， 具有低成本的優勢， 適合常規實驗室及非專業人士使用。作者使用XiE系統進行數字等溫擴增（dLAMP）， 并將其應用于H5亞型禽流感病毒的快速定量檢測[79]。與此類似， 吳必成等[80]設計了一種基于超聲振動的微液滴生成裝置， 可生成微米級的微液滴。該裝置利用控制器驅動直線超聲電機高精度移動， 通過滑臺推動注射器， 在噴嘴尖端生成微液滴， 之后利用壓電振子和噴嘴的振動， 使附著在尖端的液滴克服黏性力脫離尖端并落在一定范圍內。實驗以蒸餾水為對象， 通過該裝置成功生成了半徑小于40 μm的液滴。該裝置結構簡單， 可將液滴生成至特定區域內， 應用于多種液體微米級液滴的生成。

2.2.3?利用旋轉的毛細管生成液滴的方法?Chen等[10]提出了一種利用旋轉的毛細管生成液滴的方法（Spinning micropipette liquid emulsion， SiMPLE）， 可生成1 pL～100 nL的油包水液滴。裝置由伺服電機、偏心輪、負載平臺、注射泵、毛細管和離心管等部件構成（圖3C）。毛細管管口經過疏水處理， 浸入已預裝在離心管中的油相液面以下， 注射泵驅動毛細管中的水相進入油相， 控制毛細管轉動， 利用相界面的阻力和剪切力產生液滴。液滴產生和收集在離心管中， 能夠避免樣品的污染和損失， 有利于進行單細胞分析。通過采用由多根毛細管構成的陣列， 能夠實現高速和高通量的液滴生成。使用這種方法實現了單細胞的全基因組擴增 （Emulsion whole genome amplification， eWGA）。在此基礎上， 他們還發展了基于慣性力的液滴生成方式[81]， 利用離心機作為慣性力的產生裝置， 水在慣性力的作用下通過微通道產生微液滴， 被離心管收集。這種方法具有樣品無殘留、生成的液滴大小均勻、高速和高通量等優勢， 而且能夠實現在低溫下產生液滴。他們用產生的液滴進行了數字PCR測試， 并與商業化的儀器進行比較， 證明了這種方法的有效性和便捷性。Tang等[82]利用與SiMPLE類似的原理和裝置， 使用一個旋轉的圓錐臺， 通過外加電場控制液滴大小， 實現了液態金屬微液滴、固體水凝膠顆粒和纖維以及液態金屬核水凝膠殼微液滴的制備。

2.2.4?超疏水吸液器對微小液滴的可控制備?Guo等[78]利用超疏水網與氣體負壓系統， 制備了一種可對液滴進行快速操控的超疏水“吸液器”（圖3D）。常規狀態下， 液滴難于粘附在超疏水表面而可在其表面上自由滾動。當在超疏水網的另一側施加一個可控的負壓時， 由于內外壓差作用， 液滴將被緊緊地吸附在超疏水網上。該裝置有一彈性開關設計， 用于控制負壓的通斷， 進而控制液滴的捕獲和釋放。負壓的施加實現了超疏水表面對液滴的粘附力的高度可控， 從而實現了微小液滴的制備和操縱。利用該超疏水吸液器， 課題組精確地制備了一系列體積在0.1～3.0 μL范圍內的微小液滴， 并通過彈性開關實現了對簡單液滴反應的快速操控。超疏水吸液器可作為典型的以微液滴為基礎的反應和操控的基礎裝置， 這為解決微小液滴制備及操控的難題提供了新方式， 并且滿足了液滴微反應器、微流體和液體輸送領域的廣泛需求。

2.2.5?手持式數字移液器打印納米級液滴?Mao等[83]提出了利用手持式數字移液器（圖4A）的一種液滴生成方法， 該方法在傳統的手持式吸液管基礎上， 加裝了一次性微流控芯片， 形成手持式的數字移液器。移液器操作時由可編程的電磁致動器驅動， 通過一個小型打印裝置對裝有液體的微流控芯片進行敲擊， 使之生成液滴。與一般基于微流控芯片的液滴生成方法不同， 該方法可任意選擇液滴打印位置， 并根據需要定量生成液滴。新型移液器兼具傳統移液器技術與微流控打印技術的特點， 可用于nL級液滴的可控生成， 并可以對單個液滴進行吸取與分配等精準操作。該裝置具有高分辨率、高精度、低操控誤差、手持方便易用等優勢， 可廣泛用于各種高精度液體操控實驗， 大大節省試劑用量， 且避免了誤差積累。

2.2.6?聲波打印法?基于液滴的打印方法廣泛應用于生物微陣列和增材制造等領域， 然而， 常見的噴墨或電控液壓式印刷技術分別只適用于低粘度或特定電磁性能的材料。 Foresti等[84]發明了一種新型聲波打印技術（圖4B）， 可對各種軟材料（包括粘度跨度超過4個數量級（0.5～25000 mPa·s）的牛頓流體和屈服應力流體（τ0>50 Pa））進行按需滴印。該聲波打印液滴制備方法的核心是利用亞波長法布里珀羅諧振器的聲學特性， 產生精確并高度局部化的聲場的力， 聲場的力可超過重力兩個數量級。在該力的作用下， 液體將被以10?6～10?9 L的微小體積噴射出來， 通過控制聲場的力的大小即可實現對液滴大小的精確控制。聲波打印技術突破了以往噴墨式打印的材料限制， 適用于高粘度的蜂蜜、液態金屬、光學樹脂、生物基質等更廣泛的材料類型。這項技術未來可應用于生物制藥、食品制造、化妝品生產等領域， 在光學材料和導電材料的制備方面也具有很大潛力。

2.2.7?高頻超聲波微液滴制備技術?He等[85]成功研發了一種“高頻超聲波微液滴制備技術”（圖4C）。利用超高頻聲諧振器在固液界面上產生高度局部化且強大的作用力， 推動液體產生穩定而尖銳的液針， 并通過瞬時接觸進一步將液滴輸送到目標基板表面。這種方法介于接觸法和非接觸法之間， 因此避免了傳統方法的一些問題（如噴嘴堵塞或衛星點）。該方法可通過改變目標襯底的疏水性、諧振器尺寸、射頻信號強度及射頻信號持續時間來控制生成液滴的尺寸， 一般可生成的液滴直徑在10?6 ～10?4 m， 體積可控制范圍在10?12～10?9 L之間。利用高頻超聲波微液滴制備技術能夠在玻璃和柔性基質上實現高質量的DNA和蛋白質微陣列制備。并且由于光斑的大小可以精確地控制在10?6 m（體積上為10?12 L）， 且與金屬氧化物半導體（CMOS）的兼容性互補， 此技術容易應用于生物芯片的制作， 適用于無機、有機、生物油墨等各種不同的材料。此外， 在其它基于液滴的應用方面也具有很大潛力。

2.3?近年來發展的新方法

表1列出了近年來最新提出的制備液滴方法的基本原理、生成液滴大小和生成頻率等信息。通過對新方法的介紹及表1的總結內容可以發現， 雖然這些方法在實現形式上多種多樣， 一些方法卻遵循著相似的原理。這些方法按照液滴的生成機理或受力形式可分成以下類別：滑動芯片法利用兩塊芯片滑動所產生的剪切力將連續流體剪切成液滴; 基于界面瑞利泰勒不穩定性的液滴生成法利用離心作用下界面的不穩定性生成下墜狀液滴， SiMPLE法利用離心力克服表面張力生成微小液滴; 借助具有超親水/超疏水特性的材料， 液滴裂分法和超疏水“吸液器”法將大液滴裂分為微小液滴; 高頻超聲波制備液滴法使聲場作用力產生的穩定液體尖峰與襯底接觸， 吸附到襯底上生成液滴; XiE法、數字移液器打印法和聲波打印法均基于振動的作用， 分別利用電磁振動器引起的振動、電磁致動器敲擊及聲波力作用使液滴分離; SODA法利用可編程的“抽吸沉淀移動”方法實現了對10?12 L級液滴的自動化操控。

3?液滴生成方法發展趨勢及展望

從液滴制備技術的發展歷程看， 微液滴的生成方法經歷了傳統方法、微流控芯片方法和近年來出現的芯片外新方法， 即從無芯片到芯片再到脫離芯片的過程（如圖5所示）。本文所述的液滴制備方法各有特點及各自適用的領域， 且其實驗設備、操作技術、應用范圍隨著社會需求和科技的進步不斷發展。在此過程中， 各類方法相互借鑒， 互為補充， 為推動研究的深入發展提供了更多可能。

近年來出現的制備液滴的新型片外方法兼具傳統方法及微流控芯片方法的一些特點， 在此基礎上加以改進， 在節省試劑、降低成本、高通量生成液滴、精確控制液滴等方面具有很大優勢， 能夠更好地滿足液滴制備的需求。新方法中， SODA引入編程系統， 實現了自動化液滴生成與操控。超疏水“吸液器”方法與傳統方法中的膜乳化法均是通過施加壓力使液體透過某種特殊材料制成的薄膜來形成液滴。超疏水“吸液器”方法使用的超疏水網可在實驗室自制， 方法簡單易行。該方法還可實現液滴在疏水板上的均勻分散和選擇性捕獲等快速精確的液滴操控。手持數字移液器將微流控芯片與傳統移液器結合， 設備簡單， 可單手操作， 并且能夠對單個液滴進行精確操控， 故大大節省試劑用量并減小誤差。此外， 聲波打印技術則突破了噴墨打印技術對液滴生成材料的限制， 大大拓寬了液滴應用領域。

基于芯片的液滴制備方法以體積小、試劑耗量少、生成液滴速度快且大小均一等突破性的優勢奠定了其在生物、化學、醫藥等領域應用的基礎。但是， 微流控芯片方法在流體的控制、液滴運動的自動化、液滴產生通量、控制的靈活性等方面仍然面臨著許多挑戰[86]。此類技術對芯片的設計和加工、芯片系統外圍設備、專業人士的操作具有很強的依賴性。脫離芯片的新技術、新方法將以往的液滴生成方法與界面作用、打印技術、材料特性等結合生成液滴， 可在一定程度上解決上述問題。

目前， 研究者仍在努力發展各種微液滴生成方法。未來微液滴的生成方法將是多種不同領域交叉作用的結果， 適用范圍不斷擴大。在各領域研究者的共同努力下， 可望出現更多簡便快捷、可控、精細的方法， 滿足更為廣泛的應用需求。

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