菌核生枝頂孢霉次生代謝物對桃褐斑致病菌的抑制效果

姚秀英 劉南南 王桂清

摘要：菌核生枝頂孢霉（Acremonium sclerotigenum）作為枝頂孢屬真菌的優勢種，其次生代謝產物多樣。為了明確其對植物病害致病菌的抑制效果，以桃褐斑致病菌（Alternaria alternata）為靶標菌，采用菌絲生長速率法和孢子萌發法測定6種發酵液的抑菌活性。結果表明：PD培養基發酵液提取物對桃褐斑致病菌的抑制效果最好，對菌絲生長和孢子萌發的EC50分別為53.673 4 mg/L和808.158 4 mg/L;培養5 d的PD培養基發酵液的抑菌效果最好，對菌絲生長和孢子萌發的EC50分別為1.445 8 mg/L和309.631 8 mg/L;菌核生枝頂孢霉發酵液對桃褐斑致病菌菌絲生長的抑制效果優于對孢子萌發效果。該研究結果為將其開發成生物源農藥奠定了理論基礎。

關鍵詞：菌核生枝頂孢霉;內生菌;次生代謝物，培養條件;抑菌活性

中圖分類號：Q93 ? ?文獻標識碼：A ? ?文章編號：1674-1161（2019）03-0018-05

隨著人們對無污染、無公害綠色食品呼聲日益提高，生物防治成為繼農業防治、化學防治之后的又一種重要防治方法，許多生物殺菌劑相繼問世，并廣泛應用于生產，取得了顯著效果。植物內生菌是微生物中非常重要的類群，其可以分泌抗生素、毒素等代謝物質，誘導植物產生系統抗性（ISR），將其次生代謝物制成藥劑可起到生物防治作用，從而減少對生態環境的污染。植物內生菌為抗（抑）菌活性成分的篩選開辟了新的來源，在農業上具有非常廣闊的應用前景。枝頂孢屬真菌（Acremonium sp.）是一種世界性分布的絲狀真菌，約有130余種，主要為腐生、植物寄生和自生，具有豐富的遺傳和生態多樣性，其次生代謝物多樣（包括萜類、酚類、環肽、蒽醌類、生物堿類等），生物活性良好，是一類能夠抑制多種植物病原真菌生長的拮抗真菌。本課題從國槐枝干中分離到一種枝頂孢屬真菌，經形態、分子和致病性鑒定，最終確定為菌核生枝頂孢霉（A. sclerotigenum）。為了明確該內生菌的抑菌效果，以桃褐斑致病菌（Alternaria alternata）為靶標菌，采用菌絲生長速率法和孢子萌發法測定6種發酵液提取物的抑制活性，篩選出誘導菌核生枝頂孢霉有效次生代謝物產生的最適培養基和最適培養天數，為將其開發成生物源農藥奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌種活化與培養

目標菌為菌核生枝頂孢霉，靶標菌為桃褐斑致病菌，均由聊城大學植物病理研究室提供，在PDA培養基、25±1 ℃條件下恒溫培養5～10 d備用。

1.2 發酵液制備與提取

供試液體培養基包括：1） Fries培養基。蔗糖30.0 g，酒石酸銨5.0 g，KH2PO4 1.0 g，NH4NO3 1.0 g，MgSO4 0.5 g，NaCl 0.1 g，結晶CaCl2 0.1 g，酵母膏1.0 g，蒸餾水1 000 mL。2） Czapek培養基。NaNO3 3.0 g，K2HPO4 1.0 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4 0.01 g，蔗糖30.0 g，蒸餾水1 000 mL。3） 基礎固體培養基。牛肉膏1.8 g，蛋白胨6.0 g，蒸餾水600 mL，磷酸氫二鉀0.6 g。4） 改良沙氏培養基。葡萄糖12.0 g，蛋白胨6.0 g，蒸餾水600 mL。5） 酵母麥芽汁葡萄糖培養基（YMG）。葡萄糖4.0 g，麥芽提取物10.0 g，酵母提取物4.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 5.5±0.2。6） PD培養基。馬鈴薯200.0 g，葡萄糖20.0 g，蒸餾水1 000 mL。

在裝有300 mL不同液體培養基的錐形瓶（經高壓滅菌）中接入直徑為0.7 cm的菌核生枝頂孢霉菌片，每瓶45個。于25±1 ℃的恒溫振蕩培養箱中振蕩培養7 d，經真空抽濾得到的濾液用旋轉蒸發儀（溫度60 ℃）濃縮，直至冷凝管中無溶液滴下，得到次生代謝物粗提物。對PD培養基進行3，5，7，9，11 d培養篩選，方法如上。

粗提物用三重水溶解，配制成20 000，10 000，

5 000，2 500，1 250 mg/L的濃度梯度，用于抑菌活性測定。

1.3 抑菌活性測定方法

1.3.1 生長速率法 采用生長速率法測定不同培養基發酵液提取物對菌絲生長的抑制效果。將備用各濃度提取液與PDA培養基以1∶9的比例制成系列含藥培養基，使之終濃度為2 000，1 000，500，250，125 mg/L;接入直徑0.7 cm的靶標菌菌餅，以加入等量無菌水的PDA培養基為對照，3次重復，于25±1 ℃，L∶D=

12∶12條件下恒溫培養5 d，計算抑制率。

1.3.2 孢子萌發法 采用孢子萌發法測定發酵液提取物對孢子萌發的抑制效果。將備用各濃度提取液與靶標菌孢子懸浮液按體積比1∶5混合，使之終濃度為

3 333.3，1 666.7，833.3，416.7，208.3 mg/L;凹載玻片中加入混合液10 μL，于25±1 ℃下黑暗保濕培養24 h，3次重復，顯微鏡下觀察孢子數及孢子萌發狀況（至少觀察100個孢子），計算孢子萌發抑制率。

1.4 數據處理

利用Excel軟件進行數據統計整理，經DPSv7.05統計軟件進行方差分析、差異顯著性檢驗、相關系數、線性回歸等。

2 結果與分析

2.1 不同培養基發酵液對桃褐斑致病菌的抑制作用

2.1.1 對菌絲生長的抑制效果 培養7 d的6種培養基發酵液提取物對桃褐斑致病菌菌絲生長的抑制效果如圖1和表1所示。

由圖1和表1可以看出：不同培養基發酵液對桃褐斑致病菌菌絲生長的抑制效果不同，且抑制效果均隨著發酵液濃度提高呈現增長趨勢，即抑制率與濃度呈線性正相關。其中，PD培養基發酵液對菌絲生長抑制效果最好，各濃度的抑菌效果均在55%以上，EC50為53.673 4 mg/L;Fries培養基、Czapek培養基、基礎固體培養基、改良沙氏培養基、YMG培養基這5種培養基發酵液的抑菌效果一般，抑制率均在26%以下，EC50均超過30 000.000 0 mg/L。

2.1.2 對孢子萌發的抑制效果 6種培養基發酵液提取物對桃褐斑致病菌孢子萌發的抑制效果如圖2和表2所示。

由圖2和表2可以看出：不同培養基發酵液提取物對桃褐斑致病菌孢子萌發的抑制效果趨勢與對菌絲生長的抑制效果趨勢相同。雖然PD培養基發酵液提取物對孢子萌發的抑制效果最好，但不及對菌絲生長的抑制效果，各濃度的抑制率均在25%以上，EC50為808.158 4 mg/L，是菌絲生長EC50的15.06倍，說明其對菌絲生長的抑制效果是孢子萌發的15.06倍;其他5種培養基發酵液的抑制率均在30%以下，EC50在30 000.000 0 mg/L～170 000.000 0 mg/L之間，抑制效果較差。

綜合對菌絲生長和孢子萌發的抑制效果，說明PD培養基是誘導菌核生枝頂孢霉產生抑制桃褐斑致病菌效果最好的次生代謝物的最適培養基。

2.2 PD培養基不同培養時間發酵液提取物對桃褐斑致病菌的抑制作用

2.2.1 對菌絲生長的抑制效果 分別培養3，5，7，9，11 d的PD培養基發酵液提取物對桃褐斑病菌菌絲的抑制效果如圖3和表3所示。

由圖3和表3可以看出：不同培養時間的發酵液對桃褐斑致病菌菌絲生長的抑制效果不同，且抑制效果均隨著發酵液濃度提高而增長，即抑制率與濃度呈線性正相關。其中，培養5 d的發酵液對菌絲生長的抑制效果最好，各濃度的抑制效果均在83%以上，EC50為1.445 8 mg/L;3，7，9，11 d的抑制效果均不及5 d的抑制效果，EC50均超過6.000 0 mg/L。

2.2.2 對孢子萌發的抑制效果 不同培養時間的發酵液提取物對桃褐斑致病菌孢子萌發的抑制效果如圖4和表4所示。

由圖4和表4可以看出：除208.3 mg/L和416.7 mg/L處略低于11 d外，培養5 d的發酵液對桃褐斑致病菌孢子萌發的抑制效果總體高于其他4個時間。雖然5 d的發酵液提取物抑制效果最好，但不及對菌絲生長的效果，各濃度的抑制率均在30%以上，EC50為309.631 8 mg/L，為菌絲生長EC50的214.16倍，說明其對菌絲生長的抑制效果是孢子萌發的214.16倍;其他4個時間發酵液的EC50在315.000 0～

1 500.000 0 mg/L之間，抑制效果較差。

3 結論與討論

為了明確菌核生枝頂孢霉（Acremonium sclerotigenum）對植物病害致病菌的抑制效果，采用菌絲生長速率法和孢子萌發法測定其6種培養基發酵液對桃褐斑致病菌的抑菌活性，并進行培養時間篩選。結果表明：PD培養基發酵液提取物活性最強，培養5 d的抑菌效果最好。

從營養角度分析，培養基中普遍含有水分、碳源、氮源、無機鹽類和生長素，營養條件合適與否直接影響真菌的產毒及產生毒素的量，即影響真菌代謝產物的抑菌效果。PD培養基中的馬鈴薯浸出液含有碳源、氮源、生長物質、礦物質等多種微生物生長所需物質，有助于各種霉菌生長，而Fries缺少氮源、Czapek缺少氮源和生長物質、改良沙氏缺少礦物質、YMG缺少氮源和礦物質、基礎固體培養基缺少碳源物質，與PD培養基相比營養不全面。

枝頂孢屬不同菌種在不同培養基中培養得到的發酵物對不同病原菌的抑菌活性不同。姚磊等人利用瓊脂平板擴散法測定枝頂孢屬真菌SC0105在小麥與YMG混合培養基中發酵不同天數的發酵物對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑菌活性，結果表明，SC0105在小麥與YMG混合培養基中發酵16 d的發酵物抑菌活性最強。而本課題研究表明，菌核生枝頂孢霉（Acremonium sclerotigenum）在PD培養基中發酵5 d的發酵物對桃褐斑致病菌（Alternaria alternata）的抑菌活性最強。

對植物內生真菌的生物防治已有大量研究，結果表明，從植物內生真菌中可發現新穎且具有抗菌活性的次生代謝產物，其中某些化合物的活性較強，具有開發成為新一類抗菌藥物的潛力。菌核生枝頂孢霉作為一種內生菌，其次生代謝產物的相關研究尚少，本課題篩選誘導其對桃褐斑致病菌產生生物活性物質的發酵培養基和誘導時長，明確培養5 d的PD培養基為最適發酵條件，為將其開發成生物源農藥奠定了理論基礎。關于菌核生枝頂孢霉的殺菌抑菌譜和作用機理等均有待于進一步探索。

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