三種食用菌在溫度脅迫下菌絲酶活性的變化研究

郭 敬，易美琴，宋 波

(西華師范大學生命科學學院，四川 南充 637000)

環境脅迫是不同的環境因子對生物所處的生存狀態產生的壓力，如水分虧缺、pH、高溫、鹽堿、環境污染等環境因子都會對生物的生長產生壓力。食用菌在生長和發育的不同階段溫度、光照、含水量等環境因子的不適宜都會影響菌絲體的正常生長，最終影響食用菌的產量和品質[1]。溫度是食用菌生長發育過程中最重要的影響因素，在不同的溫度下食用菌產生的酶量不同，酶的活性高低也不同，這些不同是菌體適應環境的結果。在食用菌生長發育過程中，胞外酶將培養料的大分子裂解成能使菌絲和子實體利用的小分子物質，為食用菌的生長發育提供所需的營養物質，促進食用菌的生長，因此，胞外酶在食用菌的整個生長發育過程都起著非常重要的作用。當培養的溫度和pH值改變時，食用菌菌絲體的胞外酶和保護酶也會產生相應變化[2-5]。

中國的食用菌菌種資源豐富,白玉菇、真姬菇、杏鮑菇是目前常見的工廠化大規模栽培食用菌。目前關于溫度脅迫對食用菌酶活性影響的研究報道極少，僅限于白靈側耳、銀耳等少數食用菌的報道，對白玉菇、真姬菇、杏鮑菇尚未研究[6-7]。本研究以三種常見食用菌為實驗材料探究不同溫度和PH脅迫下，食用菌菌絲酶的活性變化，通過測定纖維素酶和淀粉酶兩種胞外酶以及過氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)兩種保護酶活性的變化，以期找出在溫度脅迫下三種食用菌對培養料的分解的程度以及利用率，探究食用菌菌絲酶活性的動態變化，為進一步研究食用菌的營養生理過程提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

白玉菇、杏鮑菇、真姬菇均購自南充某公司。

1.2 供試培養基

供試培養基配方：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、蛋白胨3g、酵母浸膏1g、瓊脂20g。

1.3 實驗設備

不銹鋼立式壓力滅菌鍋；恒溫搖床THZ-92A，上海浦東物理光學儀器廠；電子天平，BS223S，Sartorius；生化培養箱；超凈工作臺SW-CJ-IFD，蘇州凈化設備有限公司；UV752N紫外可見分光廣度計，上海佑科。

1.4 實驗方法

1.4.1 菌種的活化 用解剖刀從經過表面消毒的白玉菇、真姬菇、杏鮑菇菌蓋中部縱切一刀,切取一小塊組織,移接到平板培養基上封口，置恒溫培養箱內，23℃培養,數天后可見組織塊上長出絨毛狀菌絲，待菌絲長滿平板后備用。

1.4.2 溫度脅迫處理方法 先將菌絲接種于斜面固體培養基中放置于23℃(正常生理環境)培養一段時間，當菌絲長度長至培養皿的2/5時，進行溫度脅迫處理。將試驗組分別放置在4℃、35℃環境下培養，對照組繼續于23℃下培養。在處理后的第2天開始，每隔1d,取帶培養基的菌絲塊,進行相關酶活的測定。

1.4.3 酶的提取胞外酶的提取參照文獻[8]取菌絲培養基2g加入20mL的pH值4.8的0.1M乙酸鹽緩沖溶液，23℃下250r/min下振蕩浸提3h，過濾、定容至22mL，4℃、3500r/min離心10min，取上清(上清液即為粗酶液)，低溫保存備用。

保護酶的提取參照文獻[8]：取菌絲培養基2g加入8mL、0.05mol/L，pH值7.0的磷酸緩沖液研缽中，充分勻漿，于4℃、10000r/min離心10min，取上清(上清液即為粗酶液)，低溫保存備用。

1.4.4 胞外酶的測定方法 羧甲基纖維素酶活性和淀粉酶活性的測定參照參考文獻[9]略有改動。

表1 測定胞外酶活性時各試劑加入量

50℃水浴糖化30min,取出后立即于100℃水浴中煮沸15min，得糖化液，取糖化液0.5ml，加3,5-DNS顯色劑1ml，在100℃水浴中顯色15min，冷卻后加加入蒸餾水11ml，混勻，于分光光度計550nm處比色，定義酶促生成1μg/h葡萄糖的酶量為1個酶活力單位。

1.4.5 保護酶SOD的測定方法 超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用核黃素-NBT法測定[10]。

表2 測定SOD活性時各試劑加入量

SOD反應介質最后加入，4號試管加入SOD反應介質遮光處理，所有試管混合均勻后置于生化培養箱中光照顯色30min(各管照光一致，反應溫度24～35℃)，結束后，避光終止反應，以4號試管作空白(調零)，在560nm下測吸光度。

1.4.6 保護酶POD酶的測定方法 過氧化物酶活性(POD)采用愈創木酚法測定參照文獻[10]。

取2支試管，在一支試管中加入反應混合液3mL，KH2P04lmL作為調零對照，另一支試管中加入反應混合液3mL，保護酶粗酶液1mL，反應20min后，在470nm下測定吸光度。

2 結果與分析

2.1 溫度脅迫對菌絲胞外酶的影響

2.1.1 溫度脅迫下CMC酶活性的變化趨勢 如圖1所示經過35℃高溫處理之后24h后參考對照組

圖1 溫度脅迫下三種供試菌種CMC酶活性的變化趨勢

(23℃)變化，高溫脅迫時，杏鮑菇CMC酶活性在開始階段快速下降，到第4天時酶活性僅為初始活性的54%，之后趨于穩定；低溫脅迫時，CMC酶活性先升高，第4天達到最大值酶活性為初始活性的1.35倍，之后快速下降。而真姬菇在高溫脅迫下CMC酶活性在起初逐漸升高，第4天的酶活性約為第2天的1.3倍，之后迅速下降，在脅迫第6天時酶活性下降50%；而在低溫脅迫下，真姬菇CMC酶活性一直處于下降趨勢，第2天到第4天下降趨勢較為緩慢，第6天的酶活性僅為第2天的43%。整體上，真姬菇菌絲處于高溫時，CMC酶活性都要低于正常溫度；處于低溫時，CMC酶活性都要高于正常溫度。與杏鮑菇和真姬菇都不同，參考對照組(23℃)變化，溫度過高時，白玉菇菌絲CMC酶活性增加幅度相當明顯，在第4天達到最大值酶活性上升2.28倍，然后開始下降；而在溫度過低時，白玉菇菌絲CMC酶活性呈先下降后上升的趨勢，但變化幅度較小。

2.1.2 溫度脅迫下淀粉酶變化趨勢 如圖2所示在溫度脅迫下，杏鮑菇淀粉酶活性皆先降低，在第4

圖2 溫度脅迫下淀粉酶活性的變化趨勢

天降到最小值，然后升高。整體上，高溫脅迫下杏鮑菇菌絲淀粉酶活性比正常溫度低而低溫脅迫下，淀粉酶活性高于低于正常溫度。而真姬菇淀粉酶活性在高溫脅迫下起初升高，在第4天酶活性約為第2天的1.4倍，之后迅速下降，在脅迫第6天時接近于零；而在低溫脅迫下，真姬菇淀粉酶活性一直下降趨勢，最后趨近于零。而白玉菇淀粉酶活性先下降，在第4天到最小值，酶活性約為第2天的0.5倍之后呈上升趨勢態；不同于杏鮑菇的是，整體上，白玉菇菌絲處于高溫時，淀粉酶活性都要低于正常溫度；處于低溫時，淀粉酶活性與正常溫度相當。

由此可以看出不同溫度差異下，3種食用菌的胞外酶活性變化較為明顯。測定結果表明，杏鮑菇在高溫脅迫下，CMC酶活性下降，而真姬菇和白玉菇酶活性先升高后降低；而在低溫脅迫下，杏鮑菇CMC酶活性先升高后降低，真姬菇酶活性持續下降，白玉菇酶活性先降低后升高。而在受到溫度脅迫時，3種食用菌的淀粉酶活性都急劇變化，杏鮑菇與白玉菇變化趨勢相近，在高溫和低溫脅迫下，淀粉酶活性都先降低后升高，而真姬菇在低溫脅迫下酶活性持續下降，在高溫脅迫下酶活性先上升后下降。說明3種食用菌的菌絲胞外酶對溫度脅迫比較敏感。

2.2 溫度脅迫對菌絲保護酶的影響

2.2.1 溫度脅迫下SOD活性的變化趨勢

圖3 溫度脅迫下SOD活性的變化趨勢

如圖3：溫度變化引起杏鮑菇SOD活性升高，在高溫脅迫下，杏鮑菇菌絲酶活在第4天迅速增加約3.5倍達到最大值，之后迅速下降；而在低溫脅迫下，杏鮑菇菌絲SOD活性一直升高。與杏鮑菇不同，高溫使真姬菇活性先升高，在第4天后快速下降；而低溫使真姬菇活性緩慢下降，最后略高于對照組SOD活性。與真姬菇SOD變化大致相同，高溫脅迫使白玉菇菌絲活性先升高，在第4天后急劇下降；而不同的是，低溫下白玉菇活性緩慢下降，趨勢與對照組近似平行。

2.2.2 溫度脅迫下POD活性的變化趨勢

圖4 溫度脅迫下POD活性的變化趨勢

如圖4：參考對照組(23℃)變化，溫度過高時，杏鮑菇菌絲POD活性開始階段呈下降趨勢；而溫度過低時，杏鮑菇POD活性持續升高，后期生長階段中升幅不大。與杏鮑菇不同，與對照組相比，高溫脅迫下，真姬菇POD活性趨于穩定狀態，但要低于正常溫度時的POD活性；低溫脅迫下，真姬菇POD活性起初升高，第4天達到最大值，然后開始降低，最后趨近于零。

與杏鮑菇和真姬菇不同，在高溫脅迫下，白玉菇POD活性起初呈上升狀態，第4天達到最大值，然后開始下降，最后趨近于零；而在低溫脅迫下，白玉菇菌絲POD活性呈穩定升高趨勢。

3 討論

3.1 胞外酶與食用菌逆境生長的關系

食用菌是一類沒有葉綠素的異養型真核生物，其主要依靠產生多種胞外酶來分解營養物質，以維持其生命活動，完成生活史。由此可見，胞外酶的活性高低決定食用菌對營養物質的分解程度和效率，影響著其對營養成分的吸收和利用率，也間接影響著食用菌的產量和品質[11]。通過實測定結果得出：在食用菌菌絲生長階段，胞外酶活性在受到溫度脅迫時，酶活性有一定影響，在低溫環境下影響效果不大；胞外酶活性變化與環境有關，但環境不是決定性因素，主要起決定性作用的是食用菌的種性，即不同菌種在不同環境下，胞外酶的活性變化差異顯著，這主要是受遺傳因素的影響。

3.2 保護酶與食用菌逆境生長的關系