4種檢測方法在隱球菌性腦膜炎中的診斷價值

張江峰，張亞麗，王山梅，馬 冰，李 軼△

(1.河南省人民醫院檢驗科,鄭州 450003；2.鄭州大學第二附屬醫院消化疾病研究所，鄭州 450014)

新型隱球菌感染引起的隱球菌性腦膜炎是一種嚴重的真菌性腦膜炎，具有高患病率和高病死率。人類免疫缺陷病毒(HIV)感染和免疫功能受損是其主要風險因素。全球每年約有100萬HIV感染患者罹患隱球菌性腦膜炎，其中死亡患者至少有10萬人[1-2]。另外，隱球菌性腦膜炎也可發生于HIV陰性的免疫功能低下患者甚至免疫功能正常的患者。美國一項研究[2]顯示，約50%HIV陰性的隱球菌感染患者有中樞神經系統受累。我國有研究[3]顯示，HIV陰性的隱球菌性腦膜炎患者病死率高達28.7%。隱球菌性腦膜炎早期缺少特異性的臨床表現，誤診率較高。因此，隱球菌性腦膜炎的快速檢測及早期診斷是控制感染和預防并發癥的關鍵。本研究應用臨床實驗室常用的4種隱球菌性腦膜炎的檢測方法(墨汁染色法、培養法、膠體金法和乳膠凝集法)進行樣本檢測，旨在探討4種方法在隱球菌性腦膜炎中的診斷價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 病例組為31例經病原學檢查(墨汁染色、培養陽性)確診為隱球菌性腦膜炎病例，均為2014年1月至2018年5月河南省人民醫院神經內科和感染科的住院患者，其中男19例，女12例，年齡22～67歲。對照組為同期40例非隱球菌性腦膜炎中樞神經系統感染患者，確診為結核性腦膜炎、細菌性腦膜炎或病毒性腦膜炎。對照組男23例，女17例，年齡12～71歲。所有的腦脊液標本均為抗真菌藥物使用前采集。

1.2儀器與試劑 Bactec FX全自動血培養儀器(美國BD公司)，印度墨汁(北京華越洋DM0103)，CX22顯微鏡(奧林巴斯)，沙氏培養基(鄭州安圖公司)，二氧化碳培養箱(日本松下)，隱球菌抗原檢測試劑盒(膠體金免疫層析法，美國Immy公司)，隱球菌抗原測定試劑盒(乳膠凝集法，美國Immy公司)，質譜儀[布魯克(北京)科技有限公司]。

1.3方法

1.3.1直接鏡檢 墨汁染色選用印度墨汁，將1 mL以上的腦脊液標本3 000 r/min離心10 min，棄去上清液，取沉渣與墨汁混勻后，加蓋蓋玻片直接鏡檢。在黑色背景下，新型隱球菌可見寬厚透亮的莢膜，細胞壁明顯，有時有出芽現象。

1.3.2培養及鑒定 將腦脊液接種于BD真菌血培養瓶，置于Bactec FX全自動血培養儀進行培養，陽性培養瓶轉種沙氏培養基(SDA)37 ℃培養，采用質譜儀進行種的鑒定。

1.3.3乳膠凝集試驗 取100 μL的腦脊液樣本于100 ℃溫箱中孵育5 min，取25 μL的隱球菌抗原陽性對照、陰性對照和預處理的腦脊液標本加在環狀玻片的分離環中，并各加入25 μL的隱球菌乳膠進行混合，于室溫下手動輕搖5 min后立即觀察結果。

1.3.4膠體金法 將腦脊液標本3 000 r/min離心10 min，在反應試管中滴加1滴樣本稀釋液，取40 μL腦脊液樣本加入反應試管中，隨后將膠體金試紙條插入反應試管中，室溫孵育10 min后進行結果判讀。

1.4統計學處理 用SPSS19.0軟件進行數據分析，計數資料以率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1傳統方法(墨汁染色法和培養法)檢測隱球菌的結果比較 將病例組和對照組患者的腦脊液標本分別采用墨汁染色法直接鏡檢和直接接種培養法進行檢測，病例組腦膜炎患者腦脊液標本檢測結果顯示：墨汁染色法陽性15例，陽性率為48.4%；培養法陽性25例，6例腦脊液樣本培養結果為陰性，陽性率為80.6%。對照組腦膜炎患者腦脊液標本采用兩種方法檢測結果均為陰性。兩種傳統方法的陽性檢出率比較差異有統計學意義(χ2=7.045，P=0.008<0.05)，見表1。

表1 4種檢測方法在各組中的檢測結果(n)

2.2隱球菌莢膜多糖抗原檢測方法(膠體金法和乳膠凝集法)檢測結果比較 病例組膠體金法共檢出陽性27例對照組，陰性4例，陽性率為87.1%；乳膠凝集法共檢出陽性30例，陰性1例，陽性率為96.8%。采用膠體金法有2例腦脊液樣本出現假陽性結果，其余均為陰性結果，采用乳膠凝集法有1例腦脊液樣本出現假陽性結果，其余均為陰性結果。兩種隱球菌莢膜多糖抗原檢測方法的陽性檢出率比較差異無統計學意義(χ2=1.958，P=0.354>0.05)，見表1。

2.3不同檢測方法的靈敏度和特異性比較 墨汁染色法、培養法、膠體金法和乳膠凝集法的靈敏度分別為48.3%、80.6%、87.1%、和96.8%，特異度分別為100.0%、100.0%、95.0%、和97.5%。比較4種方法的方法學指標(靈敏度、特異度、陽性預測值及陰性預測值)，結果顯示隱球菌莢膜多糖抗原檢測方法靈敏度和陰性預測值顯著高于傳統墨汁染色法和培養法(均P<0.05)，但是，傳統方法(墨汁染色法和培養法)特異度和陽性預測值高于隱球菌莢膜多糖抗原檢測(膠體金法和乳膠凝集法)方法(均P<0.05)，見表2。

表2 4種檢測方法的靈敏度和特異性比較(%)

表3 4種方法對隱球菌性腦膜炎的檢測結果比較

2.4不同檢測方法對隱球菌性腦膜炎的檢測結果比較 墨汁染色法與其他3種檢測方法比較，檢測結果差異均有統計學意義(均P<0.05)，培養法與膠體金法和乳膠凝集法比較，檢測結果差異無統計學意義(均P>0.05)，見表3。

3 討 論

新型隱球菌廣泛存在于土壤與鴿糞中，在組織中呈圓形或卵圓形，革蘭染色陽性，菌體被寬厚的莢膜所包裹，適宜的培養溫度為37 ℃，菌落呈乳白色，日久呈黏液狀，根據其莢膜抗原性的不同可分為A、AD、D、B和C 5個血清型[4]。新型隱球菌是一種機會性致病真菌。隱球菌性腦膜炎是最常見的肺外感染，其高病死率引起全球的特別關注。據報道，2014年在低收入國家隱球菌性腦膜炎患者病死率高達70%，中等收入國家其病死率高達40%，歐美國家其病死率約20%～30%[5]。傳統的隱球菌性腦膜炎的檢測主要是以墨汁染色直接鏡檢法和培養法為主，這是基礎和經典的方法。目前，臨床常用的方法還有以隱球菌莢膜多糖抗原為檢測靶標的血清學診斷技術，比如：新型隱球菌莢膜抗原乳膠凝集法、膠體金法等以及其他如影像學、分子技術和病理組織學檢查等診斷方法。

本研究中利用墨汁染色法、培養法、膠體金法和乳膠凝集法對31例臨床診斷隱球菌性腦膜炎患者和40例非隱球菌性腦膜炎患者腦脊液標本進行檢測，結果顯示隱球菌莢膜多糖抗原檢測方法(膠體金法和乳膠凝集法)靈敏度和陰性預測值顯著高于傳統的檢測方法，尤以乳膠凝集法的靈敏度最高(96.8%)。但是傳統方法的特異度和陽性預測值高于膠體金法和乳膠凝集法。傳統的墨汁染色法是最簡便快速的診斷方法，但陽性率最低(48.3%)，低于文獻[6]報道的陽性率75.0%，主要因為該方法依賴標本的采集時機、采集量和檢驗人員的技能水平，感染早期病原菌數量少、采樣存在干擾因素或者檢驗人員經驗不足均易導致誤診和漏診。培養法是隱球菌性腦膜炎診斷的金標準，但耗時且敏感性低，不能滿足對感染的早期診斷。本研究中培養法敏感性約為80.6%，有6例未培養出，可能是由于接種量過少或者患者處于感染早期，使得腦脊液中病原菌數量過少所致。

近年來，以乳膠凝集法和膠體金法為代表的隱球菌莢膜多糖抗原的檢測方法越來越多的應用于臨床。膠體金法利用免疫層析技術，以膠體金標記單克隆抗體，可檢測新型隱球菌的全部血清型[7]。該方法不需要昂貴的儀器設備，且簡便易操作，檢測時間短，更適于床旁檢測。而且其靈敏度和特異度較傳統方法高，更適合用于隱球菌性腦膜炎的快速篩查。本研究中膠體金法的靈敏度與特異度分別為87.1%和95.0%，略低于文獻報道的91.7%和99.6%[7]。其中有4例標本出現了假陰性結果，可能是由于患者在感染早期，抗原滴度較低，且該方法結果判定依賴主觀判斷所致。乳膠凝集法是4種方法中靈敏度和特異度最高的檢測方法，分別高達96.8%和97.5%，與文獻[8]報道一致。在系統性紅斑狼瘡患者或者患者存在風濕因子的情況下可出現假陽性結果，而在感染早期或者抗原滴度高等情況下,乳膠凝集法會出現假陰性結果[6,9-10]。

總之，傳統方法對隱球菌性腦膜炎檢測更直觀且更可靠，是臨床實驗室最基本的檢測方法，尤以傳統培養法為輔助診斷隱球菌性腦膜炎的金標準。隱球菌莢膜多糖抗原檢測方法(膠體金法和乳膠凝集法)與傳統方法相比具有較高的靈敏度，可作為隱球菌性腦膜炎的早期診斷方法。其中膠體金法具有操作簡單，報告迅速且可靠的特點，可用于臨床的快速篩查，對隱球菌性腦膜炎的輔助診斷具有十分重要的意義。