STAT3在妊娠期肝內膽汁淤積癥孕婦胎盤中的表達及意義*

葉云飛,蒙文霞,陳 瀅,周一萍,李文怡,陳柏秀

(廣西科技大學附屬柳州市人民醫院產科 545006)

妊娠期肝內膽汁淤積癥(intrahepatic cholestasis of pregnancy,ICP)是妊娠中晚期最常見的特發性肝臟功能紊亂性疾病。臨床上以皮膚瘙癢及血清總膽汁酸水平升高為特點,發病率為0.2%～2.0%[1-2]。ICP是嚴重威脅母嬰健康的妊娠期并發癥，可導致早產、胎兒宮內窘迫、新生兒窒息、羊水胎糞污染等，使圍生兒病死率明顯增高[3]。ICP的發病機制非常復雜，其病因學仍不清楚。多數研究認為是遺傳變異、內分泌、免疫功能失常及環境因素等多因素共同作用的結果[4]。曹麗瓊等[5]研究報道細胞因子信號傳導負調控因子3(SOCS3)參與了ICP的發病。而對信號轉導和轉錄活化因子3(STAT3)在ICP患者胎盤中的表達尚無文獻報道。本研究通過檢測重度ICP孕婦和健康孕婦胎盤組織中STAT3、白細胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達水平，初步探討STAT3在ICP發病中的作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2016年1月至2017年12月在柳州市人民醫院產科住院治療、資料完整的剖宮產分娩的重度ICP孕婦25例為試驗組。根據中華醫學會婦產科學分會2015年公布的ICP診療指南[6]，重度ICP的納入標準：(1)血清總膽汁酸水平大于或等于40 μmol/L；(2)瘙癢嚴重伴或不伴有黃疸、皮膚抓痕；(3)復發性ICP。排除標準：排除肝炎病毒、EB病毒、巨細胞病毒感染。試驗組年齡29.3歲(27～37歲)，孕周37+3周(36～40周)。選擇同期健康順產孕婦30例為對照組，年齡28.5歲(24～36歲)，孕周39+3周(37～41周)。兩組孕婦年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)，孕周比較，差異有統計學意義(P<0.05)。兩組孕婦既往均無高血壓、心臟病、腎臟疾病、糖尿病及甲狀腺功能異常等基礎病史，無輸血及免疫治療史。本研究經柳州市人民醫院倫理委員會討論并批準，并經所有孕婦知情同意。

1.2方法

1.2.1標本收集及處理 胎盤娩出后10 min內，于臍根正對面，避開淤血、壞死及鈣化區迅速剪取絨毛組織(無蛻膜組織及羊膜)2塊約1 cm×1 cm×1 cm，其中1塊用生理鹽水沖洗并擦干，放入10%甲醛中固定24～48 h后用乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋進行免疫組織化學檢測。另1塊迅速置于10%甲醛中，用于蛋白印跡法檢測。

1.2.2免疫組織化學法檢測胎盤組織中STAT3、IL-6和TNF-α的表達 采用免疫組織化學鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶鏈接法(SP法)測定胎盤組織中STAT3、IL-6和TNF-α的表達水平，免疫組織化學試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。STAT3、IL-6和TNF-α抗體試劑盒均購自上海生工生物工程股份有限公司。操作按說明書上步驟進行。結果判定：染色結果分別由2位病理學專業醫師獨立評估。STAT3、IL-6、TNF-α陽性信號為細胞內呈現棕黃色顆粒。按陽性細胞百分率評分：0%～<5%為0分，5%～<25%為1分，25%～<75%為2分，≥75%為3分。按細胞質或胞核著色程度評分：未著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，將兩項得分相乘，<2分判為陰性(-)，≥2分為陽性(+)。

1.2.3平均光密度值測定 采用美國Media cybernetics 公司生產的Imagepro-plus 6.0專業圖像分析軟件對免疫組織化學照片進行光密度分析。每張切片選取3張400倍照片做光密度分析，

1.2.4蛋白印跡法檢測STAT3蛋白表達水平 組織裂解、離心后得到蛋白樣本，測定總蛋白濃度，上樣電泳。電泳后轉移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，加入小牛血清蛋白封閉液封閉。加入STAT3一抗(兔抗人單克隆抗體 1∶10 000稀釋)，β-actin抗體(1∶800稀釋)，4 ℃過夜，分別加入二抗(1∶10 000稀釋)，室溫孵育。ECL顯影、曝光。掃描曝光片后，應用Quantity圖像分析系統分析目的條帶，記錄條帶灰度值。蛋白印跡條帶的灰度值與內參β-actin條帶灰度值的比值作為STAT3蛋白的表達水平。

2 結 果

2.1STAT3、IL-6、TNF-α在胎盤組織中的定位及表達 STAT3在兩組孕婦胎盤組織中均有表達，STAT3定位在滋養層細胞的胞質和胞核；呈現淺黃色、棕黃色或褐色染色顆粒，STAT3在試驗組孕婦胎盤滋養層細胞中呈強陽性表達；在對照組孕婦胎盤滋養層細胞中呈弱陽性表達。IL-6定位在滋養層細胞的胞質； TNF-α定位在合體滋養層細胞胞核。STAT3、IL-6和TNF-α在試驗組中的表達明顯高于對照組。試驗組孕婦胎盤滋養層細胞中STAT3、IL-6、TNF-α平均光密度值明顯高于對照組(P<0.05)，見圖1～3。

A：對照組；B：試驗組

圖1兩組STAT3的表達(SP×400)

A：對照組；B：試驗組

圖2兩組IL-6的表達(SP×400)

A：對照組；B：試驗組

圖3兩組TNF-α的表達(SP×400)

表1 兩組中STAT3、IL-6、TNF-α細胞陽性率及平均光密度值

2.2孕婦胎盤滋養層細胞中STAT3陽性細胞率及平均光密度值 試驗組孕婦胎盤滋養層細胞中STAT3陽性細胞率明顯高于對照組(P<0.05)；試驗組孕婦胎盤滋養層細胞中STAT3平均光密度值明顯高于對照組(P<0.05)；試驗組孕婦胎盤滋養層細胞中IL-6、TNF-α陽性細胞率明顯高于對照組(P<0.05)；試驗組孕婦胎盤滋養層細胞中IL-6、TNF-α平均光密度值明顯高于對照組，兩組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，見表1。

2.3STAT3在胎盤組織中的表達定量 免疫印跡檢測顯示，對照組、試驗組孕婦胎盤組織中均可檢測到STAT3蛋白的表達，試驗組STAT3表達水平(1.05±0.10)明顯高于對照組(0.38±0.07)。兩組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，見圖4。

圖4 各組胎盤組織STAT3蛋白表達免疫印跡圖

2.4試驗組孕婦胎盤滋養層細胞中STAT3與IL-6、TNF-α的相關性分析 試驗組中STAT3表達強度與IL-6、TNF-α的表達強度呈顯著正相關(r=0.687，r=0.891，P<0.05)，見表2。

表2 試驗組STAT3與IL-6、TNF-α的相關性

3 討 論

3.1STAT3在ICP母胎界面的變化 JAK/STAT信號通路目前已成為研究細胞膜到細胞核信號傳遞中的經典信號途徑。而信號轉導及轉錄激活因子(STAT)通路是JAK/STAT信號通路研究的熱點之一。STAT3能被許多細胞因子、生長因子和其他刺激因素所激活發揮作用，激活的STAT3(P-STAT3)可以調節其他細胞因子表達，并可介導細胞的增殖、凋亡、分化等重要生理活性。FITZGERALD等[7-8]研究顯示STAT3轉錄因子的活性與絨毛外滋養細胞的凋亡、遷移和侵襲相關。曹麗瓊等[5]研究報道SOCS3參與了ICP的發病。本研究對ICP孕婦和健康孕婦胎盤組織中STAT3的表達進行分析，免疫組織化學結果顯示：STAT3定位在胎盤組織滋養層細胞的胞質和胞核；ICP時胎盤中STAT3表達水平顯著高于健康孕婦。免疫印跡實驗顯示:兩組孕婦胎盤組織中均可檢測到STAT3蛋白的表達，試驗組(1.05±0.10)明顯高于對照組(0.38±0.07)，差異有統計學意義(P<0.05)。故無論是定性實驗還是定量實驗均提示：ICP時胎盤中STAT3表達水平顯著高于健康孕婦。ICP患者的母胎界面STAT3表達增高，提示STAT3可能參與了ICP的發病。

3.2IL-6、TNF-α在胎盤中的定位及表達 近年研究發現，對一些細胞因子如IL-6、TNF-α、血管內皮生長因子(VEGF)等進行早期監測對ICP具有重要意義。IL-6是由淋巴細胞及單核巨噬細胞分泌的炎性細胞因子，有廣泛的生物學作用，可誘導B細胞分化并產生免疫球蛋白，促進T細胞增殖、生長等。IL-6在妊娠、分娩及胎兒生長發育過程中均發揮重要作用。研究[7]發現ICP患者血清中IL-6的表達明顯高于正常妊娠，且隨著病情的加重該指標值不斷升高，IL-6還可誘導內皮細胞合成和分泌黏附分子進而發揮損傷作用，據此通過監測血清中IL-6的水平可以了解ICP患者病情的嚴重程度。研究[9-10]顯示，人類子宮內膜和胎盤組織中存在大量的巨噬細胞，這些巨噬細胞在接受同種異型胎兒抗原刺激后可分泌TNF-α，適量的TNF-α可調節胎兒與胎盤組織的生長，促進滋養層細胞的合成，刺激孕酮和絨毛膜促性腺激素(HCG)的分泌，防止母體對胎兒產生排斥反應。BULL等[11]研究發現ICP患者胎盤中細胞因子TNF-α的表達明顯增加，誘發ICP發病。TNF-α誘導ICP胎盤絨毛滋養細胞凋亡，使黏附分子的表達上調，ICP患者發生體內免疫損傷和免疫排斥，TNF-α可以促進雌激素在胎盤的合成和分泌，加重ICP。TNF-α具有雙重生物學效應，生理狀態下參與機體免疫防護，病理狀態下大量TNF-α造成機體免疫損傷。從免疫學觀點來看，TNF-α屬于Th1型細胞因子[11-12]。已有研究[13-14]表明免疫功能失衡可能會破壞孕婦免疫微環境,導致孕婦出現各種病理性妊娠反應。ICP孕婦的Th1/Th2型細胞因子的平衡發生變化，Th1的表達更明顯。本研究結果顯示，ICP患者的IL-6、TNF-α表達水平比健康孕婦異常增高。這一結果與文獻[9-10]的研究結果相符合。本研究提示，IL-6、TNF-α表達的異常增高與ICP患者病理性妊娠反應有著極為密切的關系，并且可能導致胎兒不良妊娠結局的發生。

3.3STAT3與IL-6、TNF-α相關性 王斯南等[15]通過免疫組織化學法評價膽酸對IL-6/STAT3通路的激活情況。結果顯示：膽酸可通過誘導腸道低度炎性反應激活IL-6/STAT3通路。NGUYEN等[16]研究發現：STAT3是IL-6的核心效應分子。細胞因子TNF-α是體內重要的早期促炎因子，TNF-α的mRNA上有STAT3的結合位點，活化后的STAT3可以入核與TNF-α的mRNA上S1Ⅺ3的結合位點結合，增強TNF-α的轉錄，導致TNF-α的大量釋放；而細胞因子受體與相應的細胞因子結合后又可進一步促進JAK/STAT通路的活化，從而對JAK/STAT通路進行“正反饋”調節，使炎癥級聯反應不斷放大。

LUO等[17]在構建妊娠高血壓大鼠模型實驗中發現，STAT3可以改善妊娠高血壓大鼠血管內皮細胞功能，STAT3與TNF-α、IL-6的表達具有正相關性。本研究結果發現：無論是定量還是定性實驗均發現STAT3的表達與胎盤組織中IL-6、TNF-α水平呈正相關。說明IL-6對TNF-α的調控，可能是通過STAT3信號通路完成。IL-6高表達激活了STAT3表達，活化后的STAT3進入細胞核與TNF-α結合，導致TNF-α的大量釋放，從而使TNF-α表達異常增高，打破了Th1/Th2平衡，Th1表達明顯，從而導致ICP的發病最終導致ICP發病。是否可以通過阻斷該通路達到一定的治療作用，減少患者及新生兒的不良結局的發生，進而對準確及詳細分析ICP患者提供一定的參考，值得進一步研究。

綜上所述，本研究表明，通過對STAT3的檢測并結合TNF-α、IL-6的表達情況能從信號通路這一方面更深入了解ICP疾病的發病情況，開拓了ICP發病機制的新思路。而孕期通過檢測IL-6、STAT3和TNF-α水平可了解胎兒宮內環境，對臨床終止妊娠時機的選擇提供了理論依據。目前，對ICP病理生理過程認識較局限，STAT3信號通路的研究為ICP的發病提供了新的思路，而對其藥物治療提供了重要的研究方向，可針對該通路選擇對胎兒影響小，更有效的藥物進行治療，或能成為治療ICP的一條新的路徑。