楊梅素通過激活AKT信號通路抑制心肌梗死后心臟重構的研究

邵 玲，周夢橋，熊濤，鄧長金

(湖北省荊門市第一人民醫院心血管內科 448000)

心肌梗死是冠狀動脈疾病發病和死亡的主要原因。在急性心肌梗死后，心肌細胞大量死亡，觸發一系列的分子和細胞重構反應包括炎性反應、心肌細胞肥大反應、纖維化增生和膠原疤痕的形成[1]。在早期上述重構過程能夠保持心臟的完整性和維持心臟功能，然而持續的梗死后重構將最終導致左室擴張、心功能不全，最終發展成為心力衰竭[2]。目前臨床上的藥物并不能抑制甚至逆轉重構的心臟[3]，因此心力衰竭患者的發病率逐年升高。為此，尋找新的藥物靶點迫在眉睫。

楊梅素是藥物化學的重要天然產品之一，已有研究報道楊梅素具有多種功效：抗菌、抗病毒、抗癌、抗炎、抗氧化應激和降糖活性[4-6]。在心臟中的研究表明，楊梅素可以減輕大鼠心臟急性缺血再灌注損傷，可減少鹽敏感性大鼠心臟損傷[7]。此外，楊梅素還可減輕異丙腎上腺素誘導的大鼠心肌損傷[8]。上述研究均提示楊梅素可能對心肌損傷后重構具有抑制作用。本研究采用心肌梗死模型，旨在探討楊梅素對心肌梗死后心臟重構的影響和具體機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 8～10周齡雄性C57BL/6J小鼠(SPF級)，飼養于隔離屏障設施的環境中；購買于南京醫科大學實驗室動物中心，動物合格證號：SCXK(蘇)-2015-0132；動物生產許可證號：SCXK(蘇)2014-0131，體質量 23.5～27.5 g，采用隨機數字表法分為4組：對照組(n=10)；模型組(n=20)；低濃度楊梅素組(n=20)：100 mg·kg-1·d-1楊梅素灌胃處理，術后3 d開始，持續到術后4周；高濃度楊梅素組(n=20)：300 mg·kg-1·d-1楊梅素灌胃處理，術后3 d開始，持續到術后4周。

1.2試劑 楊梅素(純度大于 98%，上海融禾生物有限公司)；P-PI3K抗體(4228S)，T-PI3K抗體(4257)，P-AKT抗體(4060)，T-AKT抗體(4691)，P-mTOR抗體(2971)，T-mTOR抗體(2983)，GAPDH抗體(2118)均購自Cell Signaling Technology公司。

1.3心肌梗死模型制備 采用冠狀動脈左前降支結扎術建立心肌梗死模型。用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠后，在胸骨左緣縱行切開皮膚暴露心臟，在左心耳下緣2～3 mm處用8-0的聚丙烯縫線結扎冠狀動脈，以心電圖ST段抬高確定心肌缺血形成，對照組以相同的方法掛線，但是不結扎。迅速將心臟送回胸腔，縫合胸壁。術后3 d開始喂藥處理。

1.4超聲心動圖檢測 采用小動物超聲系統檢測小鼠心功能。收集的數據包括：左室收縮末期內徑(LVESd)，左室舒張末期內徑(LVEDd)，左室射血分數(LVEF)，左室短軸縮短率(LVFS)。

1.5心肌梗死面積的計算 術后4周，取小鼠心臟，采用中性甲醛固定，石蠟包埋切片，進行HE染色，用Iimage J1.44軟件計算心肌梗死面積。

1.6HE、天狼星紅(PSR)和免疫組化染色 采用蘇木素和伊紅進行HE染色；采用PSR進行膠原染色；采用免疫組化染色CD45和CD68，DAB顯色法進行炎癥細胞浸潤標記。

1.7RT-qPCR檢測 采用TRIzol(Invitrogen公司)提取心臟的總RNA；采用羅氏公司的反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA。采用羅氏Light Cycler 480 SYBR Green熒光定量PCR儀進行PCR擴增。所有目標基因的轉錄結果與內參基因GPADH進行對比。

1.8Western blot檢測 采用裂解法提取小鼠心臟總蛋白，采用BCA試劑進行蛋白定量。采用10%的SDS-PAGE進行凝膠電泳。所用一抗包括：磷酸化和總的PI3K、AKT、mTOR和內參蛋白GAPDH(均購買于CST公司)。采用化學發光法進行顯色，每組磷酸化蛋白的表達水平用其相應的總蛋白表達校準。

2 結 果

2.1楊梅素提高心肌梗死后小鼠存活率，改善心功能，減小心肌梗死面積 低濃度和高濃度楊梅素處理后的小鼠存活率明顯高于模型組(P<0.05)。且兩種濃度的楊梅素處理組小鼠心肌梗死面積明顯縮小(P<0.05)，其心臟重量顯著低于模型組(P<0.05)。此外，超聲心動圖結果提示低濃度和高濃度楊梅素能明顯改善心肌梗死后4周小鼠的心功能：LVESd和LVEDd明顯小于模型組，而LVEF和LVFS明顯高于模型組(P<0.05)。兩種濃度的楊梅素處理組間差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.2楊梅素降低心肌肥厚程度 心肌梗死4周后，模型組小鼠心肌肥厚程度明顯增高；心肌肥厚相關基因A型利鈉肽(ANP)、B型利鈉肽(BNP)和肌球蛋白重鏈β(β-MHC)的轉錄水平顯著增加；低濃度和高濃度楊梅素處理組均能顯著抑制心肌肥厚程度，降低心肌肥厚相關基因的轉錄(P<0.05)。高濃度楊梅素處理組效果優于低濃度處理組(P<0.05)，見圖1，表2。

表1 各組小鼠生存率、梗死面積以及心功能的比較

*：P<0.05，與對照相組比較；#：P<0.05 ，與模型組比較

圖1 各組HE染色心肌肥厚程度

圖2 各組PSR染色心肌纖維化程度

項目對照組模型組低濃度組高濃度組ANP0.32±0.013.24±0.03?1.55±0.01?#1.07±0.02?#BNP0.27±0.022.98±0.01?1.43±0.03?#1.19±0.02?#β-MHC0.14±0.023.22±0.01 ?1.09±0.02?#0.88±0.02?#Collgen Ⅰ(×10-2)1.09±0.1213.43±1.11?8.12±0.13?#6.99±0.18?#Collgen Ⅲ(×10-2)1.14±0.7614.34±1.21?8.55±1.99?#6.67±1.09?#CTGF(×10-3)2.09±1.1115.43±2.12?7.43±1.23?#5.21±1.87?#TGF-β(×10-4)1.98±0.1212.28±2.24?8.34±1.34?#6.28±1.11?#

*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與模型組比較

表3 各組小鼠心臟心肌炎癥和氧化應激水平

*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與模型組比較

2.3楊梅素降低心肌纖維化水平 心肌梗死4周后，模型組小鼠心肌纖維化及相關基因的轉錄水平顯著增加：Ⅰ型膠原蛋白(CollagenⅠ)，Ⅲ型膠原蛋白(CollagenⅢ)，結締組織生長因子(CTGF)和轉化生長因子-β(TGF-β)。低濃度和高濃度楊梅素處理組均能顯著抑制心肌纖維化水平；減少纖維化相關基因的轉錄(P<0.05)。高濃度楊梅素處理組效果優于低濃度處理組(P<0.05)，見圖2，表2。

2.4楊梅素降低心肌炎性反應 心肌梗死4周后，模型組小鼠CD45和CD68陽性的炎癥細胞浸潤明顯增多，炎癥相關基因[白細胞介素-1(IL-1)，白細胞介素-6(IL-6)，腫瘤壞死因子(TNF-α)]的轉錄水平顯著增加；低濃度和高濃度楊梅素處理組均能顯著減少CD45和CD68陽性的炎癥細胞浸潤；減少IL-1、IL-6、TNF-α的轉錄(P<0.05)。不同濃度楊梅素處理組間差異無統計學意義(P>0.05)，見表3、圖3。

2.5楊梅素降低心肌氧化應激水平 心肌梗死4周后，模型組小鼠還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶亞基gp91和P67的轉錄水平明顯增強，抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)活性明顯降低，小鼠心臟脂質過氧化中間代謝產物丙二醛(MDA)明顯增多；低濃度和高濃度楊梅素處理組均能顯著減少gp91和P67的轉錄水平；增加SOD活性，減少MDA產生(P<0.05)。不同濃度楊梅素處理組間差異無統計學意義(P>0.05)，見表3。

圖3各組CD45和CD68陽性炎癥細胞浸潤數量

表4 各組心臟AKT信號蛋白的相對表達

*：P<0.05，與對照組比較；#：P<0.05，與模型組比較

圖4 各組AKT信號通路的改變

2.3楊梅素激活AKT信號通路 模型組小鼠心臟AKT活化程度明顯降低(P<0.05)，且其上游PI3K和下游蛋白mTOR磷酸化水平降低(P<0.05)。低濃度和高濃度楊梅素處理后AKT信號通路蛋白PI3K，AKT和mTOR的磷酸化水平明顯提高(P<0.05)。不同濃度處理組間差異無統計學意義(P>0.05)，見表4、圖4。

3 討 論

以往的研究表明楊梅素通過抑制P38信號通路減輕大鼠心臟急性缺血再灌注損傷[4]。楊梅素可減少鹽敏感性大鼠心臟損傷[7]。楊梅素還可減輕異丙腎上腺素誘導的大鼠心肌損傷[8]。上述研究均側重于楊梅素對抗心肌的急性損傷作用。而本研究采用心肌梗死模型，楊梅素給予處理至術后4周，探討楊梅素對心肌梗死后心臟重構的影響，結果提示楊梅素能夠減少小鼠心肌梗死后4周的死亡率，減少心肌梗死面積，改善梗死4周后的心功能。

心肌梗死后的心臟重構是一個復雜的病理過程。在心肌梗死早期(梗死后1～2周)，壞死和凋亡的心肌細胞誘導一系列炎性反應。適當的炎性反應促進死亡的心肌細胞清除[9]；炎癥細胞分泌的促炎癥因子可誘導成纖維細胞的激活和分泌，促進心肌纖維化[10]。在疾病早期，上述重構有助于維持心臟的完整性和功能。隨著重構的持續(梗死后3～4周)，梗死周邊區域殘余的心肌細胞為滿足心臟的做功要求，發生肥厚性增生，在此過程中胚胎基因過度激活(ANP、BNP、β-MHC)，成為心臟重構的標志物[11]；此外，纖維化過度增生導致左室僵硬度增加，心室順應性降低，影響心臟的舒張功能[11]。本研究發現楊梅素能夠顯著減少心臟重量和心臟重構標志物ANP、BNP、β-MHC的表達；減少纖維化標志物Ⅰ型collagen Ⅰ、collagen Ⅲ和促纖維化因子CTGF、TGF-β的轉錄。提示楊梅素能夠阻止心肌梗死后心臟重構的發展。

在心肌梗死后期，過度的炎性反應造成促纖維化因子大量分泌，刺激成纖維細胞增殖分化和分泌，促進心肌纖維化；此外，過多的炎性反應導致心肌細胞損傷凋亡增多，心肌細胞數量減少，影響心臟收縮功能[12]。氧化應激在心肌梗死后心臟重構中發揮重要作用。在生理條件下，ROS作為第二信使發揮重要的信號傳遞功能；然而在病理條件下ROS產生和清除失衡，導致心肌細胞氧化應激損傷。一方面氧化應激引起細胞蛋白質和DNA損傷；另一方面氧化應激激活多種炎癥和心臟重構相關通路，刺激心臟重構的發生發展[13]。本研究發現，楊梅素能夠減少心肌梗死后CD45和CD68炎癥細胞的浸潤，減少促炎癥因子的合成；減少氧化酶NADPH的表達，而增加抗氧化酶SOD的活性。提示楊梅素能夠阻止心肌梗死后心肌炎癥和氧化應激反應。

PI3K/AKT是胰島素受體被激活后的重要的信號通路，在調節細胞代謝、葡萄糖攝取、細胞增殖和蛋白質合成方面發揮核心作用[14]。在心肌細胞中，AKT信號通路還參與細胞存活、血管生成、炎性反應和氧化應激。在受到胰島素信號刺激后，PI3K磷酸化激活，促進下游的AKT蛋白磷酸化激活，后者可刺激多種下游分子[15]。其中mTOR通過mTORC1復合體激活后促進細胞蛋白質合成、生長和存活[16]。本研究發現小鼠心肌梗死4周AKT信號通路蛋白明顯失活，而低濃度和高濃度楊梅素處理能夠重新激活PI3K/AKT信號通路，促進心肌細胞存活，降低小鼠死亡，抑制心臟重構的發展。

綜上所述，楊梅素能夠通過激活PI3K/AKT信號通路，阻斷心肌梗死后的心臟重構。楊梅素可能成為治療心臟重構的新思路。