Annexin A2原核表達載體的構建及表達純化

王德利，楊 華，湯海峰,王宇石

(1.吉林大學生命科學學院,吉林 長春130012;2.吉林大學口腔醫學院，吉林 長春130021)

在真核生物中，存在一類由鈣離子介導的的膜磷脂結合蛋白——膜聯蛋白Annexin家族，酵母和原核生物中未發現存在。Annexin最早是在勞什肉瘤病毒轉化的雞胚細胞中發現的。已發現的Annexin家族成員歸為五類:A類為脊椎動物膜聯蛋白；無脊椎動物膜聯蛋白屬于B類；真菌和部分單細胞真核生物被歸為C類；D類為植物膜聯蛋白；原核生物的膜聯蛋白家族屬于E類；另外還有40余種膜聯蛋白仍待歸類[1]。現已鑒定出人體內12種膜聯蛋白家族成員(Annexin A1-A11，A13)，廣泛分布于胎盤滋養細胞、內皮細胞、巨噬細胞、腫瘤細胞內外[2]。膜聯蛋白具有特異性的氨基端(表現在序列或長度各異)以及高度保守的羧基端。不同的膜聯蛋白家族成員N端不同，而正是由于蛋白N端特異的結構域賦予了不同的膜聯蛋白獨特的功能[3]。Annexin核心位于羧基端，類似圓盤狀，由約70個氨基酸殘基組成。圓盤凸起面具有鈣離子結合位點(所以在儲鈣離子的細胞器周圍也能發現膜聯蛋白分布)，該結合位點由C端核心區域高度保守的膜聯蛋白重復序列編碼。已證實的Annexins的主要功能包括介導胞吞胞吐途徑、對細胞骨架的調節作用、影響膜的通透性等[4]。氨基末端的特異氨基酸是結合信號轉導蛋白激酶的磷酸化位點，此外，氨基末端還具有S100A10蛋白二聚體的結合位點(S100A10蛋白是一類EF手型Ca2+結合蛋白)[3，5]。

Annexin A2是膜聯蛋白家族中的一員，又稱胎盤抗凝集蛋白，p36，具有穩定細胞骨架和促進纖溶酶產生的作用，該蛋白還含有mRNA的結合位點[6]。作為鈣依賴型結合蛋白的一員，Annexin A2不同于其余各類膜聯蛋白家族成員之處在于能與包膜糖蛋白B結合[7]，而這種結合是非鈣離子依賴的。Annexin A2在細胞內外均有存在，但是Annexin A2不含有信號肽序列，所以推測Annexin A2出細胞膜是由另一種機制所介導的[8]。另外，研究表明，Annexin A2的表達失調與腫瘤的形成和發展關系密切，相關資料提示它可能在腫瘤的侵襲、轉移機制的形成過程中起重要作用，且具有組織特異性，即對不同類型的腫瘤其表達水平不同[9]。比如在宮頸癌中表達上調，而在前列腺癌中表達下調[10]。Annexin A2在高轉移惡性腫瘤中的異常表達，提示我們可以把Annexin A2 作為腫瘤基因治療的靶分子，通過抑制其表達或中斷其介導的信號轉導通路，為抗腫瘤治療提供新的思路[11，12]。因此，獲得全長Annexin A2蛋白質，對Annexin A2的深入研究具有重要的推動意義。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細胞Hep G2、原核表達載體pEXS-GST、大腸桿菌菌株DH5α以及大腸桿菌菌株BL21由實驗室提供。Fast-Pfu、反轉錄試劑盒、GST親和樹脂購于北京全式金生物技術有限公司。限制性內切酶、連接酶、RNA提取試劑盒DNA marker、PP蛋白酶購于Thermo Scientific。分子克隆、電泳、大腸桿菌培養所需生化試劑購于北京化工廠。

1.2 方法

1.2.1目的基因的獲取

以人肝癌HepG2 cDNA為模板，利用Fast-Pfu和Annexin A2特異性引物(F:5’-TTGGATCCATGTCTACTGTTCACGAAATCCT-3’，R:5’-CCGCTCGAGTCATCTCCACCACACAGGTACA-3’) 進行擴增。PCR反應設置1個循環預變性(94℃，5 min)、30個循環進行擴增(94℃，20 s；62℃，20 s；72℃，80 s)以及一個循環完成擴增(72℃，10 min)。PCR產物經瓊脂糖電泳和膠回收進行收集。

1.2.2重組載體構建

回收的PCR產物和原核表達載體pEXS-GST分別使用限制性內切酶BamHⅠ和XhoⅠ進行酶切反應(37℃，2h)。酶切反應產物經瓊脂糖電泳和膠回收進行收集，按照PCR片段：質粒=3:1的比例進行連接(16℃，1h)。連接產物轉化大腸桿菌菌株DH5α，37℃倒置培養過夜。單克隆經雙酶切鑒定和測序，最終獲得重組載體pEXS-GST-Annexin A2。重組載體轉化大腸桿菌BL21，獲得重組人源Annexin A2表達菌。

1.2.3重組Annexin A2-GST誘導表達

Annexin A2表達菌利用LB培養基進行培養，待OD600達到1.0加入1 mM IPTG，繼續培養4 h，收集菌體。配置聚丙烯酰胺凝膠(上層5%，下層12%)，利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測Annexin A2的表達。

1.2.4重組人源Annexin A2蛋白質的純化

活化凍存的Annexin A2-GST表達菌，于1 L LB培養基中37℃培養至OD600達到1.0。加1 mM IPTG，16℃培養過夜，收集菌體。利用溶菌酶裂解菌體，10 000×g 30 min離心去除沉淀，上清加入GST親和層析柱。待裂解液與樹脂充分結合，棄上清，洗雜，樹脂加入PP蛋白酶4℃反應12 h。反應液經高效液相色譜濃縮，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測蛋白質的含量。

2 結果

2.1 PCR產物鑒定

用RNA提取試劑盒提取人體肝癌細胞RNA，以全RNA為模板，Anchored Oligo(dT)18為引物，反轉錄出全cDNA。再以cDNA為模板，Pfu酶催化，PCR擴增出目的基因產物，進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，目的基因大小約為1 000 bp，這與已報道的ANXA2的大小一致。結果如圖1。

圖1 Annexin A2 基因的PCR產物

2.2 目的基因和質粒雙酶切結果

以大腸桿菌DH5α為質粒來源，按質粒提取試劑盒的要求和步驟提取質粒載體，對目的基因和質粒構建載體進行BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切，通過瓊脂糖凝膠電泳對雙酶切的結果進行檢驗，結果如圖2。泳道0為Maker，泳道1中出現約1000bp大小的條帶，進一步說明PCR產物中目的基因Annexin A2的存在；泳道2上樣是雙酶切的質粒，僅出現一條帶，驗證質粒雙酶切。對目的基因和質粒進行雙酶切也能實現目的基因和質粒構建載體的分離和回收。

圖2 目的基因和質粒載體雙酶切電泳圖

2.3 篩選轉化子

將重組表達載體Annexin A2-DH轉化入大腸桿菌DH5α中，用含氨芐青霉素的LB平板成功篩選出轉化子。LB培養板含氨芐霉素，由于質粒pEXS-GST攜帶氨芐霉素抗性基因，所以能進行抗性篩選。導入質粒載體的菌落能在平板上生長，不排除質粒自連接。從平板上挑選4個大小合適的單克隆菌落，編號為1、2、3、4，分別移入5 ml LB液體培養基，過夜擴增培養后提取重組質粒進行雙酶切鑒定。結果如圖3，泳道 3有約1 000 bp的條帶出現，說明編號3的菌落質粒成功連接并克隆重組子，即菌落3是帶有重組子的菌落，而菌落1、2、4對應的泳道均未出現目的基因條帶，其原因可能在于質粒的自連接，導致目的基因和質粒載體未成功連接。而由于質粒帶有氨芐霉素抗性基因，故能夠在涂有Amp的培養基上生長，這也是必須進行雙酶切進一步鑒定重組是否成功的原因所在。切下含有ANXA2的凝膠條進行目的基因的回收，送到測序公司進行測序。測序結果驗證與GenBank上的ANXA2序列結果一致。測序結果與GenBank序列比對見圖4。

圖3 重組質粒雙酶切鑒定

2.4 重組蛋白表達鑒定

Annexin A2的表達實驗篩選出重組子，即3號單菌落含克隆重組子。以測序驗證正確的重組質粒(即3號單菌落對應的重組質粒)轉化大腸桿菌BL21，經培養后加入誘導物IPTG，誘導重組蛋白的表達，培養5 h后，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠檢驗重組蛋白的表達。脫色漂洗后制干膠保存。結果顯示55-70 kD之間的區域出現明顯的條帶，這與Annexin A2-GST蛋白的分子量(約為62 kD)相當，符合預期。圖5中，與對照組(誘導前)的對比，實驗組條帶顏色較深，說明重組目的蛋白的含量多；而對照組該條帶明顯淺于實驗組，說明目的蛋白含量少。結果符合預期。

圖4 測序結果GenBank序列比對

圖5 Annexin A2-GST蛋白質誘導表達

2.5 重組人源Annexin A2的表達和純化

蛋白質純化的各組分經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析顯示，表達菌中包含重組Annexin A2-GST蛋白質(約62kD)，經GST親和樹脂純化后，洗脫液中基本不包含雜質蛋白質，而GST親和樹脂上也僅包含PP蛋白酶降解余下的GST片段(圖6A)。通過高效液相色譜檢測酶切反應液，反應液中組分相對單一，可直接分離獲得高純度的重組人源Annexin A2蛋白質(圖6B)，滿足試驗的預期，可利用此方法獲得Annexin A2純品蛋白質。

3 討論

隨著基因工程的發展，越來越多的原核和真核生物被應用到外源蛋白的表達上來，而大腸桿菌因為遺傳背景清楚、易于操作、發酵便利等優勢，普遍應用于多種外源蛋白的表達以及質粒的提取。為了適應不同應用的要求，研究者改造大腸桿菌菌株，得到了多種不同用途的菌株，如適用于質粒擴增的E.coli DH5α和用于表達的E.coli BL21菌株，本文借助大腸桿菌構建Annexin A2的原核表達體系，成功構建重組質粒并表達目的蛋白。本文根據Annexin A2的基因序列和BamHⅠ和XhoⅠ酶的酶切位點，設計并購買引物序列。從人肝癌細胞Hep G2中提取RNA，經逆轉錄得到cDNA，PCR得到目的基因片段，再與從E.coli DH5α中提取的質粒構建載體pEXS-GST連接成重組子，轉化E.coli BL21并表達目的蛋白Annexin A2，從而得到了在原核生物中構建質粒載體并成功轉化和表達Annexin A2蛋白的方法。為后續研究Annexin A2蛋白在脊椎動物體內的生理學功能提供了基礎。但由于Annexin A2在人體內參與多種生理途徑以及在不同腫瘤中的不均一表達，為其發展為癌癥治療的潛在靶點提出了挑戰。

(A)和高效液相色譜(B)檢測純化的Annexin A2蛋白質。