TGF-β1誘導體外培養人腎小管上皮細胞的表型轉化

王雪瑤，陳 爽，王小叢*

(吉林大學第一醫院 1.心臟超聲科；2.生殖中心產前診斷中心，吉林 長春130021)

腎慢性纖維化是多種腎臟疾病發展到終末期的共同表現，是以腎小管萎縮消失、間質肌成纖維細胞增生并產生細胞外基質為特征的病理過程[1]。腎纖維化時肌成纖維細胞的來源除腎間質內固有肌成纖維細胞活化增生外，近年來研究發現腎小管上皮細胞經上皮-間充質細胞轉分化，或稱上皮向間充質細胞的表型轉化也是腎纖維化肌成纖維細胞的重要來源之一[2]。所謂上皮-間充質細胞轉分化是指腎小管上皮細胞出現了間充質細胞標記物，包括α-平滑肌動蛋白(α-SMA)和波形蛋白(vimentin)等，同時其上皮細胞標記物表達的降低或消失，如E-鈣粘附蛋白和細胞角蛋白(CK)等。關于慢性腎纖維化，據報道有促腎纖維化作用的細胞因子很多，目前較公認的促纖維化因子要屬轉化生長因子-β1(TGF-β1)[1]，TGF-β1促腎纖維化形成的機制尚未完全闡明。本研究以人腎小管上皮細胞體外培養細胞系、HK-2 細胞為觀察對象，觀察TGF-β1是否具有誘導體外培養HK-2細胞出現上皮向間充質細胞表型轉化能力，期望能為慢性腎纖維化研究提供實驗數據。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1細胞系：HK-2 細胞系(人腎小管上皮細胞體外培養細胞系)購于中國醫學科學院基礎醫學研究所，培養于含10%胎牛血清(FBS)DMEM/F12培養液。

1.1.2主要試劑：廣譜細胞角蛋白(CK)、E-鈣粘附蛋白和α-SMA的單克隆抗體，及免疫組織化學UltraSensitiveTM S-P超敏試劑盒購自福州邁新公司。TGF-β1購自Peprotech 公司。RNA抽提試劑、逆轉錄試劑，PCR試劑盒TAKARA公司產品。

1.1.3引物：根據GENBANK數據分別設計α-SMA、細胞角蛋白-19(CK-19)、波紋蛋白(vimentin)和β-actin的PCR引物，引物由上海生工生物工程技術公司合成，序列見表1。

表1 PCR引物序列

1.2 方法

1.2.1HK-2培養細胞爬片：收集10% FBS DMEM/F12培養的HK-2細胞，以4×103個/孔接種于放有蓋玻片24孔培養板， 在37℃、5%CO2條件10% FBS DMEM/F12培養24 h、無血清DMEM/F12繼續培養24 h，各誘導各組0.5 ml的DMEM/F12培養體系中加TGF-β1，使TGF-β1終濃度分別為1 μg/L、5 μg/L和10 μg/L，對照組細胞加等體積0.1M PBS代替TGF-β1。每組設10個重復樣；分別于誘導培養24 h，48 h，72 h取出蓋玻片，4%多聚甲醛室溫固定細胞30 min。

1.2.2免疫細胞化學染色：以CK和E-鈣粘附蛋白為上皮細胞標記物；α- SMA為間充質細胞的標記物。上述固定的細胞經0.1%TritonX-100細胞打孔15 min，PBS洗5 min×3次；分別滴加一抗(抗CK抗體、E-鈣粘附蛋白抗體和α-SMA抗體，1∶200稀釋)4℃過夜，按UltraSensitiveTM S-P超敏試劑盒說明操作，DAB顯色、蘇木素復染細胞核。試劑盒提供的陽性片做陽性對照，0.01M PBS代替一抗為陰性對照。結果判定：根據DAB著色的有無，細胞明確棕黃色著色為陽性，無著色為陰性。

1.2.3RT-PCR檢測：以CK-19為上皮細胞標記物；vimentin和α-SMA為間充質細胞標記物，β-actin為RT-PCR的內參。收集培養HK-2細胞，3×105接種于25 cm的培養瓶中，后續培養及TGF-β1誘導濃度分組同上，誘導培養48 h用Trlzol法提取細胞總RNA，按逆轉錄試劑說明書逆轉錄合成第一條cDNA鏈，以等量cDNA為模板進行PCR反應，分別檢測CK-19、vimentin和α-SMA 的mRNA 表達。PCR反應條件：94℃變性1 min，進入循環，94℃變性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸1 min；共 30個循環；最后72℃延伸5 min。2%瓊脂糖凝膠電泳，陽性條帶以電泳凝膠定量分析系統 (EDAS120,Kodak) 進行灰度掃描，計算各標記物mRNA相對表達量。計算公式為：mRNA相對表達=標記物 mRNA 平均密度值/內對照β-actin 平均密度值。

1.3 統計學分析簡明統計軟件10.32進行統計學分析，多組計量資料比較采用方差分析，相互比較，兩組均數之間用q檢驗，P<0.05具有顯著性差異。

2 結果

2.1 TGF-β1誘導HK-2細胞的免疫細胞化學染色

在TGF-β1濃度分別為1 μg/L、5 μg/L和10 μg/L條件下誘導培養HK-2細胞至24 h，其上皮細胞標記物E-鈣粘附蛋白的陽性染色與對照組相比無明顯差異；繼續誘導48 h E-鈣粘附蛋白染色強度有所減少；當誘導培養至72 h 各誘導組細胞E-鈣粘附蛋白表達與對照組相比明顯減少，10 μg/L TGF-β1誘導組E-鈣粘附蛋白染色消失為陰性。但上皮細胞的另一個標記物CK的陽性表達，無論是在誘導培養的24 h、48 h、還是72 h與對照組相比均未見有明顯差異。同時間充質細胞的標記物α-SMA免疫細胞化學染色表現為：誘導培養致48 h，各誘導組細胞均出現α-SMA染色的可疑陽性；繼續誘導培養達72 h，各誘導組細胞的α-SMA陽性染色明確，即各誘導組HK-2細胞出現了明確的間充質細胞標記物的陽性表達。 以5 μg/L的TGF-β1誘導組，HK-2細胞的α-SMA陽性表達最強。即HK-2細胞經TGF-β1誘導培養后，其上皮細胞標記物E-鈣粘附蛋白表達明顯減少，同時出現有間質細胞標記物α-SMA的陽性，說明TGF-β1誘導使體外培養的HK-2細胞出現了上皮向間充質細胞的表型轉化。

2.2 TGF-β1誘導RT-PCR檢測

為驗證免疫細胞化學染色結果，選擇CK-19為上皮細胞標記物，α-SMA和vimentin為間充質細胞標記物，以同樣的TGF-β1濃度和條件誘導培養HK-2細胞48 h，RT-PCR檢測各標記物的mRNA表達，結果見表2。表2中可見在TGF-β1濃度分別為1 μg/L、5 μg/L和10 μg/L誘導培養后， HK-2細胞的上皮細胞標記物CK-19 mRNA的陽性表達對照組相比未見有明顯改變，但其間充質細胞標記物α-SMA和vimentin的mRNA表達出現了明顯的增高，間質細胞標記物mRNA的表達增高也是以5 μg/L TGF-β1誘導組為最明顯，與免疫細胞化學染色結果相對應。進一步提示TGF-β1可誘導HK-2細胞出現上皮-向間充質細胞的表型轉化，以TGF-β1濃度為5 μg/L誘導組細胞的表型轉化最為明顯。

表2 HK-2細胞各標記物mRNA相對表達量(mean±s，n=4)

*P<0.01 與對照組相比;ΔP<0.01與另兩劑量組比較

3 討論

腎間質內肌成纖維細胞形成及其產生的細胞外基質積聚被認為是慢性腎纖維化的關鍵因素[3]。1995年Strutz等觀察到腎小管上皮細胞在接觸腎毒素后可轉化成具有纖維細胞特征的細胞并能表達波形蛋白，率先提出了腎小管上皮細胞的“上皮-間充質細胞轉分化”概念，現亦可稱為“上皮向間充質細胞的表型轉化”，隨后越來越多的實驗提示腎小管上皮細胞出現的表型轉化是腎纖維化肌成纖維細胞重要來源之一[4,5]。到目前為止，人們認為腎纖維化肌成纖維細胞的來源至少有如下幾種可能：腎間質成纖維細胞，血管旁周細胞，骨髓來源的纖維細胞，腎小管上皮細胞，血管內皮細胞和巨噬細胞[6]。

無論肌成纖維細胞的來源如何，腎纖維化均是由腎臟損傷所釋放的損傷因子引起，包括：TGF-β1、結締組織生長因子、白細胞介素-1、血管緊張素II、蛋白酶、纖溶酶元激活物抑制劑-1和糖化終產物等[1.3,7]；損傷因子刺激或誘導腎內肌成纖維細胞形成并產生細胞外基質[7]。為進一步探討腎纖維化的形成機制，本研究選擇目前較公認的促纖維化因子TGF-β1，觀察TGF-β1是否具有誘導體外培養人腎小管上皮細胞系HK-2出現上皮向間充質細胞的表型轉化，結果顯示在TGF-β1濃度分別為1 μg/L、5 μg/L和10 μg/L條件下，雖然HK-2細胞CK的免疫細胞化學陽性染色始終未見有明顯改變；但上皮細胞另一個標記物E-鈣粘附蛋白的陽性染色則有所降低，誘導至72 h E-鈣粘附蛋白陽性染色與對照組相比明顯減少，10 μg/L TGF-β1誘導組E-鈣粘附蛋白表達甚至消失；同時間充質細胞標記物α-SMA在HK-2細胞誘導培養48 h出現了可疑陽性染色，繼續誘導至72h α-SMA的陽性染色明確。 說明TGF-β1能夠誘導體外培養的HK-2細胞出現上皮向間充質細胞的表型轉化。為驗證免疫細胞化學染色的結果，本研究用RT-PCR進一步檢測各標記物的mRNA；結果顯示HK-2細胞經TGF-β1誘導，其間充質細胞標記物α-SMA和vimentin的 mRNA表達明顯增高，但上皮細胞標記物CK-19的mRNA表達未見有明顯降低或消失，這與免疫細胞化學染色結果相對應。 本實驗從mRNA 和蛋白水平上證實了TGF-β1可誘導HK-2細胞出現間充質細胞的標記物的陽性表達和表達增高,但其上皮細胞標記物僅表現為部分標記物表達的減少或消失，并非是所有的上皮細胞標記物表達的減少消失，該現象意義尚不清楚。實際一直以來體內的腎小管上皮細胞是否有完整“上皮-間質細胞轉分化”始終存有爭議，因為通過譜系追蹤方法在體內無法證明腎小管上皮細胞能完全轉變為肌成纖維細胞[8]，因此近期研究又提出了“部分上皮-間質細胞轉分化”的概念，主要是指腎小管上皮細胞獲得間質細胞的部分特征如表達α-SMA等，但并未完全轉化為肌成纖維細胞，并且認為腎小管上皮細胞雖未能轉變為肌成纖維細胞，但其出現的細胞表型改變或表型轉化足夠影響腎纖維化的進程[9,10]。

從TGF-β1誘導的劑量上看，本實驗免疫細胞化學染色和RT-PCR檢測結果均顯示間充質細胞標記物α-SMA和vimentin陽性表達的最強出現在TGF-β1濃度為5 μg/L誘導組，并非是濃度最高的10 μg/L組，促纖維化因子TGF-β1在體內促腎小管上皮細胞發生表型轉化等一系列過程是否也依賴于TGF-β1的計量等相關問題有待于進一步研究。

總之，本研究結果顯示TGF-β1可誘導體外培養的HK-2細胞發生上皮向間充質細胞的表型轉化，表型轉化能力與TGF-β1劑量相關；進一步提示促纖維化因子TGF-β1可通過促腎小管上皮細胞的表型轉化參與或促進慢性腎纖維化的形成。