攜帶人肝癌細胞CDK2基因的rAAV載體的構建與鑒定

于水瀾，姜 穎，于英君，宋高臣

(1.黑龍江中醫藥大學基礎醫學院,黑龍江 哈爾濱150040;2.牡丹江醫學院,黑龍江 牡丹江157011)

研究發現，肝癌的發生是多因素、多基因相互作用的結果，與腫瘤相關的癌基因的過度表達或抑癌基因的表達缺失都會導致腫瘤的發生。目前除了傳統的化療、放療及手術治療外，靶向基因治療成為研究熱點[1]。腺相關病毒(AAV)具有感染范圍廣、免疫反應低、定點整合、攜帶的外源基因可持續穩定表達等特點，目前已成為基因轉移最為理想的載體之一[2]。CDK2基因是細胞周期蛋白依賴性激酶(CDKs)家族的成員之一，在細胞周期G1/S期的轉換過程中起著限速作用[3-5]。本實驗以此作為肝癌基因治療靶點，以AVV作為基因轉導載體[6-9]，構建rAAV-shRNA-CDK2，希望能為肝癌基因治療提供新的理論依據和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

質粒載體pAKD-shRNA、包裝質粒 pAAV-RC 和輔助質粒pHelper均購自上海艾博思生物科技有限公司(見圖1，圖2，圖3)；感受態細胞株DH5α，購自Takara公司；HEK-293細胞，購自上海艾博思生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1重組質粒pAKD-shRNA-CDK2的構建

利用KpnⅠ和BgIⅡ酶將質粒載體按酶切反應體系進行酶切處理，產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將前期設計合成的針對靶基因的特異性siRNA序列上添加KpnⅠ(-GTAC-)和BgIⅡ(-GATC-)內切酶的酶切位點序列與轉錄終止序列，合成完整的shDNA序列。經退火反應后，形成兩端帶有KpnⅠ和BgIⅡ酶切位點的雙鏈寡核苷酸片段，標記為CDK2-shRNA。雙鏈DNA連接入酶切載體，取100 μl感受態細胞加入10 μl 連接產物進行轉化，根據CDK2-shRNA序列設計一對PCR引物：Primer(+):5′-ATTTGCATGTCGCTATGTGTTC-3′；Primer(-):5′-TAAAGGGAACAAAAGCTGGGTA-3′，進行菌落PCR鑒定及DNA測序。

圖1 質粒載體pAKD-shRNA 圖2 包裝質粒pAAV-RC 圖3 輔助質粒pHelper

1.2.2重組腺相關病毒的包裝、純化

常規方法培養AAV-293細胞，觀察細胞生長情況，當細胞達到70-80%融合時采用AAV Helper Free系統將三質粒共轉染AAV-293細胞，進行重組腺相關病毒的包裝。轉染結束后，更換10 ml 新鮮的培養液放置培養箱中繼續培養72 h，熒光倒置顯微鏡下觀察細胞中報告基因 EGFP 的表達情況，以便判斷是否共轉染成功。進一步對病毒進行收集、濃縮和純化。

1.2.3病毒載體滴度測定

對重組腺相關病毒rAAV-shRNA-CDK2采用定量PCR的方法進行滴度測定。將待測病毒樣品用DNase和RNase于37℃消化2-3 h，提取病毒DNA，沸水浴5 min使之變性，立即置于冰上2 min，將病毒樣品與標準品做倍比稀釋成不同濃度，進行定量PCR檢測，所用引物為：forward：5′-CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-3′，reverse：5′-GCAGAATCCAGGTGGCAACA-3′。PCR結束后，根據標準品繪制標準曲線，計算病毒樣品滴度，單位用v.g/ml來表示。

2 結果

2.1 質粒載體的線性化

將質粒載體利用Bgl II和KpnI酶進行酶切處理，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，發現在大約6 943 bp處出現陽性條帶(見圖4)。

2.2 轉化菌質粒鑒定

為了證明轉化菌質粒含有正確序列的shDNA，我們挑取白色陽性克隆菌落進行PCR檢測。對結果進行2%瓊脂糖凝膠電泳分析，第4、6泳道在大約174 bp處可見陽性條帶，與預期結果一致，表明此陽性菌落含有目的DNA片段，轉化成功(見圖5)。取6號轉化子進行DNA測序，測序引物為Primer(+)：5′-ATTTGCATGTCGCTATGTGTTC-3′。

2.3 重組載體序列測定分析

采用DNAStar的MegAlign軟件進行序列比對分析，結果證實所選送測序的堿基為正確序列的shDNA，寡核苷酸片段位于177位至241位(65個堿基)處 (見圖6)。

圖4 載體酶切圖譜

圖5 菌落PCR產物瓊脂糖凝膠電泳

注：N，M分別為陰性對照組和Marker DL2000，第1-10泳道為轉化子樣本。

圖6 DNA測序報告

2.4 共轉染AAV-293細胞的轉染效率

于三質粒共轉染AAV-293細胞后48 h光鏡下觀察，細胞呈現不規則的多角形，貼壁狀態良好，胞漿透亮，胞核隱約可見(圖7)，在熒光顯微鏡下可以看到綠色熒光布滿整個細胞，分布較均勻(圖8)，提示轉染效率符合實驗要求。

圖7 自然光源下觀察 rAAV轉染48 h(200×) 圖8 熒光觀察rAAV轉染48 h(200×)

2.5 病毒滴度檢測

采用定量PCR方法進行滴度檢測，繪制標準曲線，，表明線性關系非常好(R2=0.999 4)，通過比對標準曲線計算病毒基因組拷貝數，其平均滴度為3.56×1012v.g/ml(見圖9)。

圖9 標準曲線

3 討論

近年來AAV由于其宿主細胞廣、能夠長期穩定表達以及免疫原性低等優勢已被廣泛應用于基因治療領域。本實驗利用AAV Helper Free系統進行病毒包裝，消除了活的輔助病毒及產生野生型AAV的危險，該系統是一個更安全、更方便，并且可以替代逆轉錄病毒和腺病毒的基因送遞系統，提高了我們實驗的生物安全級別[10,11]。

本研究采用Helper-Free系統三質粒共轉染293細胞的方法成功構建rAAV載體[12,13]，獲得了能有效沉默人肝癌細胞CDK2基因表達的重組病毒rAAV-shRNA-CDK2。接下來我們將通過動物體內注射將該病毒載體導入肝癌皮下移植瘤模型裸鼠，進一步研究與明確CDK2在肝癌細胞中的變化情況，并希望通過該研究能為肝癌的基因治療提供新的有效方法。