脂聯素亞型及濃度對類風濕關節炎軟骨細胞促炎作用的影響

李炳彤，賈淑媛，李 萍

(吉林大學中日聯誼醫院 風濕免疫科，吉林 長春130033)

類風濕關節炎(RA)是一種慢性系統性自身免疫性疾病，以持續性滑膜炎和關節軟骨和軟骨下骨的進行性損傷為特征[1]。軟骨細胞與滑膜成纖維細胞(一種RA關節病變的主要效應細胞[2])相互作用，同時軟骨細胞的存活狀態和細胞外基質的代謝狀態直接影響關節功能[3]。脂聯素，也稱為GBP28，apM1，Acrp30或AdipoQ，于1995年被發現，研究顯示其為脂肪細胞中高表達的蛋白質[4-6]。脂聯素并不是一個同質的單一體，而是由不同寡聚體的幾種亞型組成。低分子量(LMW)脂聯素，也稱Trimeric脂聯素，由3個全長脂聯素單體組成，中分子量(MMW)脂聯素，由2個三聚體結合形成的六聚體，高分子量(HMW)脂聯素，由三聚體形成的十二到十八聚體[7]。此外，不同脂聯素亞型在不同細胞中作用也不同[8，9]。研究發現，與健康人相比，RA患者的血清和關節滑液中的脂聯素水平增加[10]，但脂聯素對RA病理生理的影響，尤其是對軟骨細胞的作用還不明確。因此，本研究旨在探討不同濃度和亞型的脂聯素與類風濕關節炎患者的軟骨細胞(RAC)產生炎癥因子之間的關系。

1 材料與方法

1.1 軟骨細胞的分離和培養

軟骨組織取自吉林大學中日聯誼醫院行膝關節置換術的RA患者及行創傷修復的健康人。RA患者的診斷符合1987年美國風濕病協會(ACR)修訂的分類標準，健康人均排除風濕性疾病。本研究獲得吉林大學中日聯誼醫院倫理委員會批準，患者均同意將其組織細胞用于研究。在無菌條件下取關節表面的軟骨組織，剪碎后用胰酶和膠原酶消化。分離的軟骨細胞經200目濾網過濾后，用含10%FBS的DMEM培養液在37℃、5%CO2條件下培養。

1.2 脂聯素刺激軟骨細胞

使用25 μg/ml、50 μg/ml和100 μg/ml濃度的HMW/MMW、Trimeric和Native脂聯素分別刺激RAC和人軟骨細胞(HC)，37℃、5%CO2條件下培養15小時，本研究刺激時間的選擇基于其他實驗研究[11]。收集培養上清液，分裝后儲存于-20℃以便下一步分析。

1.3 酶聯免疫吸附(ELISA)法檢測培養上清液中的TNF-α、MMP-3以及MMP-10水平

收集培養體系的上清液，采用ELISA法檢測基質金屬蛋白酶(MMP)-3、MMP-10和腫瘤壞死因子(TNF)-α的濃度，其中MMP-10試劑盒購自Abnova公司，MMP-3和TNF-α試劑盒購自博士德公司，檢測過程嚴格遵照說明書。

1.4 統計分析

2 結果

研究發現與未刺激的RAC相比，不同濃度HMW/MMW、Trimeric和Native脂聯素均可刺激RAC分泌MMP-3、MMP-10和TNF-α增加。HMW/MMW脂聯素100 μg/ml與RAC共培養后，其分泌MMP-3的濃度增加至19.54倍，而MMP-10和TNF-α的濃度也較基礎濃度升高，相應增加至1.74倍和1.54倍。應用100 μg/ml濃度的Trimeric脂聯素刺激RAC后，MMP-3、MMP-10和TNF-α的濃度均較基礎濃度升高，相應增加至7.10倍、1.07倍和1.22倍。應用100 μg/ml濃度的Native脂聯素刺激RAC后，MMP-3、MMP-10和TNF-α的濃度增加至13.74倍、1.49倍和1.36倍。三種脂聯素刺激RAC分泌炎癥因子的水平升高，與未刺激RAC和相同濃度脂聯素刺激的HC相比均有統計學差異(如表1)。

表1 三種脂聯素亞型刺激RAC分泌炎癥因子的差異

p1表示與僅用培養液培養的RAC相比較；p2表示與相同條件下HC相比較。MMP,基質金屬蛋白酶;TNF,腫瘤壞死因子;RAC,類風濕關節炎患者的軟骨細胞;HC,健康人的軟骨細胞。

進一步分析了不同濃度(25 μg/ml、50 μg/ml和100 μg/ml)的3種不同亞型脂聯素對RAC和HC分泌MMP-3、MMP-10和TNF-α的作用程度，結果如圖1。3種脂聯素對RAC和HC分泌炎癥因子的作用均隨濃度增加而增大。在3種脂聯素中，HMW/MMW亞型脂聯素作用最強，Native脂聯素作用次之，而Trimeric亞型脂聯素作用最弱，且三者之間的差異具有統計學意義(P<0.01)。

圖1 濃度遞增脂聯素亞型對RAC和HC的刺激作用

* 表示與Native和Trimeric脂聯素相比，P<0.01。MMP,基質金屬蛋白酶;TNF,腫瘤壞死因子;RAC,類風濕關節炎患者的軟骨細胞;HC,健康人的軟骨細胞。

3 討論

近年來，人們越來越關注脂肪因子在自身免疫性疾病發生發展中的重要作用。有學者已證實脂肪因子可作用于關節軟骨、滑膜阻止以及T、B淋巴細胞[12]。脂聯素是脂肪因子的一種類型，已有多篇文獻證實在RA的脂聯素在RA病情進展中起促炎作用[13，14]，另外，也有研究表明，與骨關節炎相比，RA患者血清和關節液的脂聯素的水平明顯升高[10，15]。經過我們的前期研究，還發現RA患者血清中不同脂聯素亞型的表達水平不相同，且各亞型脂聯素水平均明顯高于健康人[16]。這些研究結果均提示脂聯素對RA發生發展起重要作用，但針對不同濃度脂聯素亞型對RAC影響的研究較少。本文主要探討不同濃度和亞型的脂聯素與RAC分泌炎癥因子的關系，并選取MMP-3、MMP-10和TNF-α 3種與RA病理機制密切相關的炎癥因子重點研究。

RA的重要病理改變是關節軟骨和骨的破壞，進一步導致患者殘疾并影響患者生活質量，而MMPs(如MMP-3和MMP-10)，在關節軟骨及骨破壞過程中發揮重要作用[17]。MMPs在正常組織中的表達極其微弱，而在病變組織中異常升高[15]。我們的研究結果發現HMW/MMW、Trimeric和Native三種脂聯素亞型均可刺激RAC表達MMP-3和MMP-10，并且這種刺激作用隨濃度升高而增大，同時我們還發現HMW/MMW亞型脂聯素的刺激作用最強，也就是說，HMW/MMW亞型脂聯素的可能在促進關節軟骨基質的破壞發揮了重要作用。

已有大量文獻證實，在多種自身免疫病(特別是RA)的發生發展中TNF-α發揮了重要的促炎作用[18]，但脂聯素在TNF-α表達過程中是發揮促炎還是抑炎作用，目前尚無定論。Ehling研究團隊發現脂聯素并不影響類風濕關節炎滑膜成纖維細胞表達TNF-α和血管內皮生長因子(VEGF)的水平[11]。但是，Lee等研究表明脂聯素能夠誘導炎癥關節的成骨細胞分泌MMP-1、MMP-13、VEGF、白細胞介素(IL)-6和IL-8[19]。值得注意的是，上述研究均使用Native脂聯素，而未對不同亞型脂聯素的作用差異進行深入探討。本研究發現HMW/MMW、Trimeric和Native脂聯素均能濃度依賴性地升高RAC中TNF-α的水平，并且HMW/MMW亞型脂聯素的作用最強，表明不同脂聯素亞型可能通過升高TNF-α對RA關節炎癥及關節破壞發揮作用。

綜上所述，HMW/MMW、Trimeric和Native脂聯素亞型均可通過促進RAC中MMP-3、MMP-10和TNF-α的分泌進而發揮促炎作用，其中HMW/MMW脂聯素作用最強。因此，HMW/MMW脂聯素可能在RA關節軟骨基質破壞和血管翳形成的病理過程中發揮重要作用。盡可能降低關節內脂聯素的水平，特別是HMW/MMW亞型，可能是治療RA的新方法。