膽管癌手術患者程序性死亡配體1的表達與患者中性粒細胞淋巴細胞比例的關系及其臨床意義研究

王金濤,張 成,楊 林,安東均,王 羊,趙寶國,韓 立

(咸陽市中心醫院 肝膽外科,陜西 咸陽712000)

肝外膽管癌(Cholangiocarcinoma,CCA)是來源于肝外膽管上皮細胞的一種不常見但非罕見的惡性腫瘤，外科完全切除腫瘤(包括達到組織學切緣陰性)是肝外膽管癌患者獲得長期生存的唯一方法，但由于其解剖部位的特殊性及生物學特征，手術切除率較低，預后差[1]。因此，對膽管癌患者而言，新的分子病理探索顯得尤為重要。

CCA的分子發病機制涉及伴有或不伴有肝吸蟲產生多種因子的長期炎癥反應。最近的研究也表明炎癥標志物，即中性粒細胞/淋巴細胞比值，是CCA預后不良的標記[2,3]。T淋巴細胞在膽道癌的炎癥中是常見的細胞類型，患者的T和B淋巴細胞與更長的生存期相關[4]。程序性死亡配體-1(Programmed death ligand-1，PD-L1)是B7家族成員之一，由290個氨基酸組成。膜型PD-L1屬I型跨膜蛋白，由胞內區、跨膜區及胞外區組成。PD-L1的胞外區與活化T細胞表面的程序性死亡受體-1(Programmed death receptor-1，PD-1)結合，通過PD-L1/PD-l途徑誘導T細胞凋亡并抑制其增殖，參與抑制抗腫瘤細胞免疫。越來越多的證據表明，阻斷PD-1/PD-L1通路可以使多種癌癥產生持久的反應，延長其生存周期，包括黑色素瘤，肺、腎腫瘤[5-7]。因此，從這種新穎的免疫療法角度出發，阻斷PD-1/PD-L1通路是有望成為治療CCA的方法。

PD-L1的表達在多種腫瘤組織中都有報道并與預后差相關[8,9]。然而，在CCA領域中尚未見PD-L1相關文獻報道。本研究旨在探討PD-L1的表達及其與CCA患者的臨床病理特征及總生存期的關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取我院2015年1月至2017年5月間收治的46名接受手術切除肝外膽管癌患者的臨床資料和病理標本，所有患者術后病理診斷明確，術前沒有進行放化療等抗癌治療，并具有完整的隨訪資料。該研究獲得醫院倫理委員會的批準，并在病人取樣前獲得知情同意。

1.2 免疫組化

取切除的病理標本用石蠟切片機切片至7 μm厚度，42℃水浴展片，撈片，55℃烘箱過夜。之后依次經二甲苯脫蠟、梯度乙醇復水、檸檬酸抗原修復液修復，按照1∶100滴加一抗(兔抗人PD-L1抗體,Abcam公司)。24 h后，PBS洗滌3次后，滴加生物素標記的二抗(Sigma公司)，然后再滴加親和素標記的過氧化物酶，PBS洗滌3次后，顯色5 min，待顯色完全后蒸餾水終止顯色，蘇木素復染1 min，洗滌后風干，中性樹膠封片。

1.3 PD-L1表達的評分

在腫瘤細胞膜表達的量化由兩個人獨立統計結果。當腫瘤細胞膜染色>1%時，PD-L1即被定義為陽性。

1.4 預處理系統炎癥，營養和腫瘤標志物的分析

預處理的血液標本進行常規全血計數和白蛋白分析。白細胞、血小板、中性粒細胞和淋巴細胞計數用全自動血液分析儀分析。血清白蛋白、膽管癌抗原(CEA)和癌癥抗原19-9(CA19-9)是用自動分析儀測量。全身炎癥反應由中性粒細胞-淋巴細胞比值(NLR)來衡量，NLR的定義是中性粒細胞絕對數除以絕對淋巴細胞計數。沒有病人在血液采樣時感染或膿毒癥的臨床記錄。

1.5 統計學分析

采用SPSS 20.0 進行統計分析，計量資料以均數±標準差表示。使用頻率和百分比描述分類變量。組間比較采用獨立樣本t檢驗，采用Fisher精確檢驗分析PD-L1和臨床病理特征之間關聯，采用Cox回歸模型進行生存分析。P<0.05被認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 入組患者的臨床資料

這項研究共包括46名病人，年齡中位數為57.5歲，大部分患者為男性(72%)。亞型為肝內CCA(n=33)和肝外CCA(n=13)。此外，中度至高度分化組有39例患者，低分化腫瘤組有7例患者。TNM分期Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ分別診斷出4,10,12和20位患者。發現7例患者(15.2%)診斷出有遠處轉移，18例患者(39.1%)有淋巴結受累。所有患者在手術后均接受氟尿嘧啶為基礎的化療(表1)。

表1 CCA患者的基本特征(n=46)

2.2 PD-L1在腫瘤細胞中的表達及臨床病理特征

在膽管癌組織中PD-L1陽性表達的患者有32例(69.6%)(圖1)。在多數低水平的陽性表達的患者中，PD-L1的表達從1.2%到34.7%，中位數為1.75% 。46位患者的PD-L1表達和臨床變量之間的關聯匯總見表2。有一個顯著高的NLR(>3)和PD-L1表達(OR=5.36，P=0.018)及TNM Ⅳ階段的疾病(OR=3.98，P=0.046)有顯著的相關性。PD-L1 的陽性表達和患者年齡、性別、病理淋巴結狀態、腫瘤分級、血清白蛋白沒有顯著的相關性。此外，PD-L1的陽性表達和腫瘤標志物CEA與CA 19-9也沒有相關性(表2)。

A.PD-L1在膽管癌患者樣本的表達。棕黃色代表PD-L1的表達強度;B.PD-L1在正常樣本的表達(放大倍數：400X)

表2 CCA患者的基本特征(n=46)

2.3 PD-L1陽性率及整體生存率

最終，44例患者(95.6%)去世。總生存期中位數為7.77個月(95% CI 5.3-10.20)。相比PD-L1陽性患者生存中位數為7.23個月(95% CI 4.27-10.19)，PD-L1陰性的患者生存中位數為7.97個月(95% CI 1.43-14.51)。PD-L1陽性腫瘤患者沒有明顯死亡風險增加的趨勢(HR=1.39，95% CI 0.72-2.68，P=0.32)(圖2)。

圖2 PD-L1表達與膽管癌患者術后生存時間的關系

3 討論

膽管癌占消化系統惡性腫瘤總數的 2%-3% ，近年來，其發病率與病死率逐年攀升。因其特殊的解剖學部位以及侵襲性生長的特點，根治性切除率僅為 15%-20% 。該病早期缺乏特異性臨床表現及有效的篩查手段，就診時多為中晚期，預后極差，平均生存期為 6-12 個月,5 年生存率為 0-16.5%[10]。

本實驗中的研究對象 PD-L1 在淋巴與非淋巴組織中均可調節外周組織中 T 細胞和 B 細胞的免疫應答及炎癥反應。PD -1 可通過與 PD-L1 結合傳遞抑制信號，負性調控機體免疫應答過程，抑制 T 細胞的增殖以及細胞因子的分泌，介導腫瘤免疫耐受，促進腫瘤細胞生長[11]。Wang 等[12]通過建立 COX 比例風險回歸模型分析發現 PD-L1 可作為胰腺癌患者預后評價的獨立指標。PD- L1 在胃癌組織、 非小細胞肺癌組織、 結直腸癌組織中高表達，且與淋巴結轉移相關，其機制與 PD-L1 受體在轉移淋巴結中特異高表達有關。David R 等[13]證實乳腺癌組織中 PD-L1 表達明顯升高，且與分化程度呈負相關，與TNM 分期呈正相關。近年來，在許多癌癥中，PD-L1已經被發現表達和作為治療免疫檢查點抑制劑的靶點，但對 PD-L1 對膽管癌作用的研究僅見于個別文獻[14,15]，具體機制仍不清楚。本研究發現PD-L1 在膽管癌組織及癌旁組織中呈陽性或弱陽性表達，而在正常組織中呈陰性表達。70%膽管癌患者的PD-L1表達上調，PD-L1的表達增加NLR的基線，且PD-L1與系統性炎癥存在顯著相關。與其他文獻相同的是，我們發現PD-L1的表達與更高階段的疾病有相關性，而與患者的年齡、性別、淋巴發現結節狀態或腫瘤分級沒有相關性。有趣的是，在這項研究中，系統性炎癥的標記物NLR的增加和PD-L1的高表達呈顯著正相關。NLR在許多癌癥中都被研究，包括膽管癌，是一個預后不良的因素[2,3]。在最近的meta分析表明，術前高NLR與膽管癌患者短的生存時間相關。據我們所了解，本實驗是首次研究膽管癌中NLR和PD-L1之間關聯的報道。本研究的缺陷是樣本數量小并且缺乏一些臨床資料。

綜上所述，在70%的膽管癌中觀察到PD-L1的表達，且PD-L1陽性表達與NLR的增加和較高的腫瘤分期呈相關性。因此，PD-1/PD-L1通路是一個潛在的免疫治療肝膽癌的新靶點。