非結(jié)核分枝桿菌病實(shí)驗(yàn)室診斷方法分析及臨床應(yīng)用

陳 蕾，王鳳平，徐俊馳，歐萌萌，方斌斌，呂 玨

(1．蘇州市第五人民醫(yī)院 檢驗(yàn)中心，江蘇 蘇州215007；2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫精神衛(wèi)生中心，江蘇 無錫214002；3.無錫市第二人民醫(yī)院,江蘇 無錫214002)

非結(jié)核分枝桿菌(NTM)是分枝桿菌屬內(nèi)不包括MTB復(fù)合群和麻風(fēng)分桿菌以外的其它分枝桿菌，到現(xiàn)在共發(fā)現(xiàn)154種NTM和13個亞種[1]，主要為腐物寄生菌，少部分對人體致病。可侵犯人體肺部、泌尿系統(tǒng)、淋巴結(jié)、皮膚及軟組織等組織器官，可引起全身播散性感染。2012年非結(jié)核分枝桿菌病診斷與治療專家共識指出，NTM病呈快速增多趨勢，成為威脅人類健康的公共衛(wèi)生問題。非結(jié)核分枝桿菌病臨床表現(xiàn)、受累組織病理改變、胸部影像(X線/CT)與肺結(jié)核十分相似，臨床將NTM感染誤診為結(jié)核病診治屢見報道，且NTM對臨床常用一、二線抗結(jié)核藥天然耐藥，造成久治不愈[2,3]。如何利用結(jié)核病實(shí)驗(yàn)診斷技術(shù)早期診斷非分枝桿菌病提診斷依據(jù)，特別是抗酸涂片陽性疑似肺結(jié)核患者減少誤診率。

1 材料與方法

1.1 研究對象及分組選擇本院2013年11月-2016年3月診治肺結(jié)核和非結(jié)核分枝桿菌感染患者共512例，其中確診為非結(jié)核分枝桿菌病(NTM)患者194例，年齡20-87歲，平均年齡57歲，男女比例為1.85∶1.0；肺結(jié)核患者318例，年齡14-89歲，平均年齡43.5歲，男女比例為3.12∶1.0；健康對照組20例，年齡23-45歲，平均年齡35歲，男女比例為1.75∶1.0。NTM與肺結(jié)核診斷參考2012年非結(jié)核分枝桿菌病診斷與治療專家共識及2013年中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病分會制定《肺結(jié)核診斷和治療指南》[4]，且細(xì)菌學(xué)分枝桿菌培養(yǎng)均為陽性病例。健康對照組為胸部X線無感染影像且無肺結(jié)核臨床表現(xiàn)健康體檢者。研究對象分組情況見表1。

表1 研究對象及分組情況

1.2 痰液標(biāo)本檢測方法研究對象按要求留取清晨痰液于痰液標(biāo)本留置器內(nèi)(含殺菌液)，取部分進(jìn)行萋爾-尼爾遜涂片查抗酸桿菌，痰抗酸涂片按照《痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊》要求操作。取部分痰液利用Bactec MGIT 960進(jìn)行分枝桿菌培養(yǎng)，培養(yǎng)陽性樣本行改良羅氏藥敏及菌型鑒定；臨床分離培養(yǎng)陽性株用于提取分枝桿菌DNA行PCR擴(kuò)增檢測，選用北京博奧生物有限公司結(jié)核分枝桿菌解決方案，包含檢測儀器、結(jié)核分枝桿菌DNA檢測試劑盒、菌種鑒定試劑盒。從分離株樣本采集、核酸提取、PCR擴(kuò)增、芯片雜交、芯片掃描及結(jié)果判讀，均嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)操作說明進(jìn)行；以陰性、陽性質(zhì)控品和陽性定量參考品的Ct值作為參考判定。比例法羅氏藥物敏感試驗(yàn)每批均以結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)減毒株H37Ra(ATC25177)進(jìn)行質(zhì)控，所有實(shí)驗(yàn)操作均按照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》、《江蘇省臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)技術(shù)管理規(guī)范》要求進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)人員均具有中級以上職稱并通過江蘇省分子診斷實(shí)驗(yàn)技術(shù)培訓(xùn)。

1.3 血液標(biāo)本檢測方法疑似患者留取痰液標(biāo)本后一周內(nèi)采集血液標(biāo)本，采集一管肝素鋰抗凝鮮全血5 ml用并于2 h內(nèi)送檢，用于γ-干擾素體外釋放試驗(yàn)(TB-IGRA)檢測，另一管分離膠血清管用于結(jié)核抗體蛋白芯片檢測。TB-IGRA檢測使用北京萬泰生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的γ-干擾素體外釋放試驗(yàn)檢測試劑盒，結(jié)核抗體蛋白芯片為南京大淵生物技術(shù)工程有限責(zé)任公司偍供的試劑盒，均嚴(yán)格按照說明書操作。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法收集資料用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，應(yīng)用靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值評估上述結(jié)核實(shí)驗(yàn)室檢測方法的診斷效能，率的比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1痰抗酸涂片、TB-IGRA、結(jié)核蛋白芯片檢測指標(biāo)在194例非結(jié)核分枝桿菌病與318列肺結(jié)核患者陽性率比較結(jié)果見表2。其中痰抗酸涂片陽性率分別為56.1%、47.5%，結(jié)核蛋白芯片陽性率分別為64.9%、67.6%，非分枝桿菌病組和肺結(jié)核組痰涂片和結(jié)核蛋白芯片檢測陽性率分析，兩者顯示無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。TB-IGRA檢測陽性率肺結(jié)核組達(dá)85.5%，非分枝桿菌病組19.6%，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析有顯著性差異(P<0.01)。

表2 三種檢測指標(biāo)非分枝桿菌和肺結(jié)核組陽性率比較

2.2TB-IGRA檢測指標(biāo)在194例NTM和318例MTB檢測靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值比較結(jié)果見表3。TB-IGRA檢測指標(biāo)在非分枝桿菌涂陽組敏感度最低(17.4%),陰性預(yù)測值(22.3%)；TB-IGRA檢測指標(biāo)在肺結(jié)核涂陽組敏感度最高(88.1%)，陰性預(yù)測值(51.3%)。

表3 TB-IGRA檢測指標(biāo)在NTM和MTB診斷效能結(jié)果

2.3選取臨床分離培養(yǎng)238株分枝桿菌經(jīng)改良羅氏培養(yǎng)菌種初步鑒定，其中結(jié)核分枝桿菌110株、牛結(jié)核分枝桿菌83株、非結(jié)核分枝桿菌45株。經(jīng)DNA微陣列芯片法菌種鑒定結(jié)果，其中結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群193株，45株非結(jié)核分枝桿菌包括胞內(nèi)分枝桿菌29株，海分枝桿菌和潰瘍分枝桿菌1株，堪薩斯分枝桿菌12株，鳥分枝桿菌1株，偶然分枝桿菌2株。臨床分離結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群對常用抗結(jié)核耐藥情況，鏈霉素耐藥率最高達(dá)14%、異煙肼耐藥率9.8%、利福平耐藥率6.2%。分離到5種45株NTM主要是胞內(nèi)和堪薩斯分枝桿菌，其對常用一線抗結(jié)核藥物均顯示高度耐藥。見表4。

表4 臨床分離培養(yǎng)238株分枝桿菌DNA微陣列芯片法菌種鑒定結(jié)果及抗結(jié)核耐藥情況

3 討論

非結(jié)核分枝桿菌(NTM)是除結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTB)和麻風(fēng)分枝桿菌以外的其它分枝桿菌[5,6]。2012年中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病學(xué)分會于非結(jié)核分枝桿菌病診斷與治療專家共識指出，NTM病感染呈快速增多趨勢，成為威脅人類健康的重要公共衛(wèi)生問題[7]。利用結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室技術(shù)提高對NTM病的診斷水平，減少NTM對健康的威脅。目前針對NTM病診斷具有呼吸系統(tǒng)臨床表現(xiàn)，胸部影像學(xué)發(fā)現(xiàn)有空洞、多病灶支氣擴(kuò)張及小結(jié)節(jié)病變等，標(biāo)本無污染條件下細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)到NTM，才能確診為NTM病[8,9]。細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)周期長、陽性率不高，免疫學(xué)方法存在交叉反應(yīng)，未篩選到靈敏度和特異度都高的診斷抗原，合理選擇聯(lián)合利用現(xiàn)有結(jié)核病實(shí)驗(yàn)技術(shù)是提高對NTM診斷早期診斷有效手段。

本研究從痰抗酸涂片、結(jié)核蛋白芯片、TB-IGRA檢測指標(biāo)在194例非結(jié)核分枝桿菌病(NTM)與318例肺結(jié)核病陽性率比較，痰抗酸涂片與結(jié)核蛋白芯片在兩組疾病陽性率比較相近，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析兩組間均無顯著性差異(P>0.05)。2013年中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病分會制定《肺結(jié)核診斷和治療指南》，痰抗酸涂片只能證明抗酸桿菌存在，并不能區(qū)分是MTB還是NTM感染，存在敏感性低，但因方法操作簡單、快速，適合基層實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用，作為肺結(jié)核篩查指標(biāo)[10,11]。從我國歷年結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查報告顯示，非分枝桿菌分離率從1990年4.9%上升到2000年11.1%，2010年則高達(dá)22.2%，反應(yīng)NTM病呈快速上升態(tài)勢[12,13]。本院從2013年11月-2016年3月共分離到368例NTM株，陽性率達(dá)15.8%，NTM培養(yǎng)陽性率呈上升趨勢，與文獻(xiàn)報道相一致。結(jié)核蛋白芯片技術(shù)作為簡便快速診斷結(jié)核病方法，檢測人血清中特異性脂阿拉伯甘露糖抗原(LAM)、抗原38 kD、16 kD抗體診斷結(jié)核病[14]。從表2可見結(jié)核蛋白芯片在診斷肺結(jié)核有一定臨床價值，但其在非結(jié)核分枝桿菌感染時同樣出現(xiàn)較高陽性反應(yīng)，NTM和MTB兩組陽性率經(jīng)卡方檢驗(yàn)無顯著性差異(P>0.05)。分析原因可能所檢測三種結(jié)核特異抗原在非分枝桿菌感染出現(xiàn)交叉免疫，敏感度與特異性欠佳，對于陽性結(jié)果臨床應(yīng)綜合分析。

TB-IGRA檢測結(jié)核分枝桿菌ESAT-6、CFP-10為抗原剌激機(jī)體產(chǎn)生特異性γ-干擾素，在診斷結(jié)核病特別是肺外結(jié)核有較高靈敏度。從表3可見，TB-IGRA檢測在肺結(jié)核涂陽和涂陽組均有較高靈敏度(88.1%、83.2%)可作為肺結(jié)核病早期篩查重要指標(biāo)，與王宗義等報道一致[15]。而TB-IGRA檢測指標(biāo)在NTM組靈敏度不到20%，且有較好的陰性預(yù)測值，提示TB-IGRA指標(biāo)在鑒別診斷NTM和MTB有良好應(yīng)用價值。回顧分析194例NTM病患者發(fā)現(xiàn)，由于NTM和MTB在臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)、影像學(xué)表現(xiàn)、組織病理等表現(xiàn)極為相似，若無菌型鑒定結(jié)果易誤診為肺結(jié)核。本文病例高達(dá)80%NTM病例初診為肺結(jié)核入院，并予以抗結(jié)核治療，造成治療效果差、周期長，并出現(xiàn)藥物性肝腎功能損害、白細(xì)胞數(shù)量下降等不良反應(yīng)。本文實(shí)驗(yàn)對疑似患者痰液樣本利用Bactec MGIT 960進(jìn)行分枝桿菌培養(yǎng)，培養(yǎng)陽性液體樣本均經(jīng)抗酸染色證實(shí)，隨后進(jìn)行改良羅氏藥敏及菌型初步鑒定。根據(jù)鑒別培養(yǎng)管上分枝桿菌生長情況，如兩種鑒別培養(yǎng)管中培養(yǎng)基上無分枝桿菌生長，則為牛結(jié)核分枝桿菌；如兩種鑒別培養(yǎng)管中培養(yǎng)基上生長，則為非結(jié)核分枝桿菌菌群；如對硝基苯甲酸(PNB)培養(yǎng)基上分枝桿菌不生長而噻吩2-羧酸肼(TCH)培養(yǎng)基上有分枝桿菌生長，則報告為結(jié)核分枝桿菌。臨床疑似患者利用Bactec MGIT 960結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性液體分離株進(jìn)行分枝桿菌菌種鑒定(DNA微陣列芯片法)。結(jié)核分枝桿菌DNA微陣列芯片法針對臨床常見分枝桿菌設(shè)計特異性PCR擴(kuò)增引物以及種屬特異性寡核苷酸片段探針。以臨床分離的致病菌株DNA為模板，運(yùn)用獨(dú)特不對稱PCR技術(shù)擴(kuò)增，引物末端標(biāo)記熒光分子，擴(kuò)增過程中待檢DNA分子被擴(kuò)增并帶有熒光標(biāo)記DNA片段。將帶有熒光標(biāo)記PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與微陣列芯片探針進(jìn)行雜交反應(yīng)，分枝桿菌種屬特異性寡核苷酸探針與序列匹配的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物形成穩(wěn)定二級結(jié)構(gòu)。采用基因芯片微量點(diǎn)樣技術(shù)，探針在芯片特定位置排列，推斷出相應(yīng)被測細(xì)菌DNA相關(guān)信息，鑒定出細(xì)菌的種類[16]。本文實(shí)驗(yàn)使用博奧生物晶芯分枝桿菌菌種鑒定試劑，可檢測包括臨床常見分枝桿菌的17個種或群。從表4中可見，臨床分離培養(yǎng)238例分枝桿菌利用微陣列芯片技術(shù)進(jìn)行菌種鑒定，其中193株為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，其中3種一線抗結(jié)核藥耐藥率大于5%。45株NTM菌種鑒定包括5種NTM，其中胞內(nèi)分枝桿菌29株(64.4%)、堪薩斯分枝桿菌12株(26.7%)、偶然分枝桿菌2株、海分枝桿菌-潰瘍分枝桿菌和鳥分枝桿菌各1株,5種NTM對臨床常用一線抗結(jié)核藥物均顯示高度耐藥，與盛青等報道相一致[17]。臨床病例誤診誤治極易造成患者病程遷延，肺內(nèi)病灶纖維增殖，使得NTM治療周期更久。而TB-IGRA檢測指標(biāo)在NTM組有較好陰性預(yù)測值，在臨床診療中對于TB-IGRA檢測陰性疑似肺結(jié)核患者，應(yīng)盡早多次進(jìn)行分枝桿菌培養(yǎng)或有條件進(jìn)行支氣管活檢組織和灌洗液培養(yǎng)，以提供細(xì)菌學(xué)確診依據(jù)。在細(xì)菌學(xué)分枝桿菌培養(yǎng)結(jié)果未報告前，考慮到臨床療效不確切，治療費(fèi)用和抗結(jié)核藥物不良反應(yīng)，臨床醫(yī)生可對于癥狀輕微患者，不進(jìn)行早期抗結(jié)核治療。

本研究發(fā)現(xiàn)痰抗酸涂片、結(jié)核蛋白芯片在早期篩查肺結(jié)核病時有一定臨床應(yīng)用價值，但其在NTM和MTB感染均可顯示陽性反應(yīng)，對疑似NTM感染患者無法鑒別診斷。TB-IGRA檢測在NTM組有較好的陰性預(yù)測值，可作為NTM和MTB鑒別診斷指標(biāo)，尤其是痰抗酸涂片陽性而TB-IGRA檢測陰性疑似肺結(jié)核患者，應(yīng)充分考慮NTM感染，給臨床提供早期診斷依據(jù)。