低氧運動對胰島素抵抗大鼠脂肪組織缺氧狀況的影響

陳圣菊，尚畫雨，白勝超，張 荷，張俊芬，邱平學，周 越

相關報告顯示，當前全球有2億肥胖患者，而中國肥胖人口已達6 200萬，居全球第二，增速為全球之最[1]。肥胖個體通常伴有脂肪組織的炎性介質分泌增加和局部缺氧[2]。隨著肥胖的發展，脂肪細胞體積變大(主要集中于腹部和睪周)，功能紊亂，出現胰島素抵抗(insulin rsistance，IR)等多種病理特征[3]。其中由脂肪組織分泌的炎癥因子導致的慢性炎癥是肥胖和胰島素抵抗的關鍵連接機制，這種慢性炎癥反應是IR發生的重要因素，但目前肥胖引起IR形成的具體分子機制尚未明確。缺氧是脂肪組織功能紊亂的一個重要原因。低氧誘導因子 -1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)的激活是低氧應答的主要機制，其α亞基對氧比較敏感，通過轉移到細胞核內與β亞基結合進而激活其靶基因[4]，影響紅細胞的生成、炎癥及糖代謝，是機體缺氧反應的重要標志物，被稱為“缺氧基因表達的總開關”。葡萄糖轉運蛋白-1(glucose transporter 1，Glut-1)是最早發現并且在人體內分布最為廣泛的轉運體，是HIF-1α的下游調控因子，二者在低氧反應中起著關鍵作用，被視為維持機體內氧平衡的主要調節因子[5]。

前期研究表明，機體缺氧與胰島素敏感性降低有關，但其具體作用及分子機制尚未闡明。關于胰腺β細胞功能的研究表明，常氧運動可在一定程度上改善胰腺β細胞功能，而慢性間歇低氧可能通過氧化應激損害胰腺β細胞的功能，β細胞凋亡增加，進而導致IR[6]。但Kolesnyk等[7]觀察到，在糖尿病動物中，間歇性低氧訓練干預可抑制其胰島的破壞，有助于形成新的腺泡，從而保護β細胞的功能。低氧暴露能否加劇脂肪組織的缺氧狀況?在低氧和運動的雙重影響下HIF-1α和Glut1的表達如何變化?低氧、運動及低氧復合運動均可以改善飲食誘導的肥胖大鼠血脂代謝，低氧復合運動能夠更好地改善血脂代謝[8]，可能是低氧與運動共同改善了IR。因此，本研究以腎周和睪周脂肪組織為切入點，觀察IR大鼠脂肪組織重量、形態學及蛋白表達的變化，探究低氧運動對脂肪組織缺氧狀況的影響，為運動治療肥胖和IR提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

5周齡健康雄性Sprague-Dawley大鼠48只，購于北京維通利華實驗動物有限公司，許可證編號：SCXK(京)2012-0001，體重140 g～160 g。 大鼠飼養及訓練均于北京體育大學實驗動物中心進行，且已通過北京體育大學運動科學實驗倫理委員會批準。大鼠分籠飼養，每籠4只，自由飲水，室溫(21±2)℃，相對濕度50% ±10%，晝夜照明，室內通風良好，隔天稱重。

1.2 實驗分組及干預方案

將大鼠隨機分為對照組(C，n=8)和高脂組(HFD，n=40)，C組每天均給予足夠的普通飼料喂養，建模組大鼠給予高脂膳食，高脂飼料(research diets，D12492)購于北京博奧派克生物科技有限公司，熱量為5.24 kcal/g(脂肪60%，碳水化合物20%，蛋白質20%)。高脂膳食8周后，取HFD組和C組各8只，禁食12 h，對其行腹腔注射葡萄糖耐量 試 驗 (intraperitonealglucose tolerance test，IPGTT)。腹腔注射50%濃度的葡萄糖，注射劑量按照每公斤體重2 g計算。分別于注射后0、30、60、120 min尾靜脈采血，血糖儀測定血糖濃度，根據文獻[9-10]計算曲線下面積(AUCBG)。具體操作方法和篩選標準成果已發表[8]。

將建模成功的大鼠(n=24)隨機分為常氧安靜組(NC，n=6)、常氧運動組(NE，n=6)、低氧安靜組(HC，n=6)和低氧運動組(HE，n=6)，普通飼料喂養，正式實驗前稱重，各組大鼠體重無顯著性差異。HC組和HE組進行低氧干預，NE組和HE組進行運動干預。低氧模擬海拔3 500 m高度，氧濃度約為13.7%，適應性訓練1周后進行為期4周的跑臺運動，大鼠體重及運動方案見表1。

表1 大鼠低氧訓練實驗安排Table 1 Rats hypoxia training experimental arrangement

1.3 樣本采集

4周干預結束后行IPGTT試驗，計算IR指數(HOMA-IR)及胰島素敏感性指數(ISI)。腹腔麻醉取材，稱量各組大鼠體重及腎周和睪周脂肪組織重量，稱重后另取睪周脂肪少許，OCT包埋后投入液氮速凍，之后轉移至-80℃冰箱保存，用于后期制作冰凍切片；取腎周脂肪裝入凍存管中，投入液氮速凍，之后轉移至-80℃冰箱保存，待測。

1.4 主要儀器與試劑

電子精密天平(JA1003)，上海天平儀器廠；冰凍切片機(LEICAUC6i)，德國；奧林巴斯(OlympusⅨ71)倒置顯微鏡圖像采集系統，日本；垂直板蛋白電泳槽、電轉槽及電泳儀，Bio-RAD公司，美國；凝膠成像(Chemi Doc TMXRS)，Bio-RAD 公司，美國；酶標儀(xMarkTMMicroplate Spectrophotometer)，Bio-RAD公司。

BCA蛋白定量試劑盒，貨號-23225，Pierce公司；發光液，貨號-34080MN Super Signal West Pico；化學發光底物Thermo SCIENTIFIC；PVDF膜，Millipore公司；預染蛋白 Marker，貨號 -P7708，NEW ENGLANG BioLabs；HIF-1α 抗體，貨號 -ab2185，abcam公司；Glut-1抗體，貨號 -ab652，abcam 公司；小鼠抗GAPDH單抗，貨號-TA-08，北京中山金橋生物技術有限公司；HRP標記山羊抗兔IgG，貨號-ZB-2301，北京中山金橋生物技術有限公司；HRP標記山羊抗小鼠IgG，貨號-ZB-2305，北京中山金橋生物技術有限公司。

1.5 測試指標與方法

1.5.1 脂肪組織HE染色

冰凍切片機上調節溫度為-30℃，將樣品厚度調為12 μm，4%多聚甲醛固定后行HE染色，甘油封片。具體操作步驟按試劑盒說明書進行，每個樣本連續切10張切片，處理完畢后于切片的中心視野處采集圖像，采用Image Pro Plus 6.0軟件處理圖像。

1.5.2 Western Blot方法檢測脂肪組織中HIF-1α和Glut-1蛋白表達

電子天平稱量脂肪組織的質量，按一定比例加入裂解液，勻漿并離心，取上清液于4℃冰箱暫存。BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，具體操作方法按照試劑盒說明進行。加入上樣緩沖液，充分混勻后100℃加熱10 min，備用。按一定比例配制SDS-PAGE凝膠進行電泳，而后進行轉膜，將蛋白轉移到PVDF膜上。5%BSA封閉2 h后進行一抗雜交(HIF-1α1：500，Glut-1 1：500，GAPDH 1：2000)，利用Gel-pro軟件進行條帶灰度值統計分析。

1.6 統計學處理

采用SPSS19.0統計軟件分析，實驗數據均以平均數±標準差(ˉx±s)表示。組內比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齊性時用Bonferroni方法進行組間多重比較，方差不齊時采用Tamhanes'方法；采用多因素單變量方差分析對低氧和運動進行二者交互作用和主體間效應分析。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 低氧運動對IR大鼠體重的影響

如圖1所示，4周低氧運動后，NE、HC和HE組較NC組體重顯著下降(P＜0.05)，且體重增長率也低于NC組大鼠；與NE組相比，HC和HE組體重顯著增加(P＜0.05)，體重增長率也高于NE組；與HC組相比，HE組體重顯著下降(P＜0.05)。

多因素單變量方差分析結果顯示，低氧和運動都對大鼠體重具有顯著影響(P＜0.05)，2者具有交互作用(P＜0.05)。

2.2 各組大鼠脂肪細胞直徑的變化情況

如圖2所示，對各組大鼠睪周脂肪細胞行HE染色實驗，顯微鏡下可見脂肪細胞NC組體積較大且大小不等，細胞充盈，有較大脂滴，交界處可見融合，有合成大細胞的趨勢，有較多的炎性細胞浸潤；其余3組細胞體積明顯減小，大小均一且細胞邊界明顯，炎性細胞浸潤減少。

圖1 低氧運動4周后,各組大鼠體重變化統計結果Figure 1 The results of weight changes of rats in each group after 4-week hypoxic exercise

統計結果顯示(圖3a、3b)，經過4周的低氧運動，各組大鼠的內臟脂肪含量較NC組顯著減少(P＜0.05)，且脂肪體重比也明顯下降(P＜0.05)；與NE組相比，HC組大鼠內臟脂肪含量和脂肪體重比顯著升高(P＜0.05)，HE與NE組無顯著性差異，但HE組較HC組的內臟脂肪含量和脂肪體重比顯著降低(P＜0.05)。

圖2 低氧運動4周后,10×20倍光鏡下各組大鼠脂肪組織HE染色結果Figure 2 HE staining results of adipose tissue of rats in each group under 10×20 light microscope

對HE染色結果進行統計(圖3c)，結果顯示，與NC組相比，NE、HC、HE 3組的細胞直徑顯著性減小(P＜0.05)且3組間脂肪細胞直徑無明顯差異。

多因素單變量方差分析結果顯示，低氧和運動均對脂肪重量、體脂比及脂肪直徑的變化具有顯著性影響(P＜0.05)，2者具有交互作用(P＜0.05)。

圖3 四周低氧運動后,各組大鼠內臟脂肪重量、體脂比及脂肪細胞直徑統計結果Figure 3 The results of VW,VW/BW and Diameter in each group

2.3 低氧運動對脂肪組織HIF-1α和Glut-1表達的影響

統計結果顯示(圖4)，經過4周的低氧運動，其余三組的HIF-1α的蛋白表達水平較NC組明顯降低，具有顯著性差異(P＜0.05)；與NE組相比，HC組顯著升高(P＜0.05)，HE組也略有升高但無統計學意義(P＞0.05)；HE組較HC組略有降低但無顯著差異(P＞0.05)。

圖4 四周低氧運動后,各組大鼠HIF-1α和Glut-1的蛋白表達的變化Figure 4 Changes of the expression of HIF-1α and Glut-1 protein

與NC組相比，NE、HC、HE組Glut-1的蛋白表達均無明顯變化，但HE組較HC組Glut-1的蛋白表達顯著降低(P＜0.05)。

多因素單變量方差分析結果顯示，低氧和運動都對HIF-1α表達有顯著性影響(P＜0.05)，2者具有交互作用(P＜0.05)；低氧和運動對Glut-1表達不具有顯著性影響(P＞0.05)。

3 討論

3.1 低氧運動對體重及脂肪組織的影響

本研究選用60%來自脂肪的高脂膳食喂養5周齡雄性SD大鼠，利用一系列動態觀察有效地展現了經過4周低氧運動后，IR大鼠的體重、脂肪重量、睪周脂肪細胞直徑以及蛋白表達的變化，為排除個體差異，計算脂肪重量與體重比。結果發現，與NC組相比，其余3組的體重都明顯降低且體重增長也低于NC組，4組的體重增長量分別是初始體重的2.7、1.7、2.4和2.1倍。單獨低氧較對照組體重也明顯下降，可能是低氧提高了機體安靜狀態的代謝率，使脂肪細胞代謝增強從而減少了脂肪重量。低氧、運動及低氧復合運動都能使體重降低，且單純運動和低氧復合運動效果較好。

本研究團隊前期研究結果表明，4周低氧運動干預后，各組大鼠胰島素敏感性均有所改善，但低氧對胰島素敏感性的改善不如運動顯著，可能是因為運動能更好的促進葡萄糖轉運蛋白(Glucose Transporter)4向細胞膜轉運，增強了攝取葡萄糖的能力[8]。

伴隨著IR的系統性低度慢性炎癥狀態的發展，脂肪組織促炎因子分泌增多，而抗炎因子分泌減少，導致炎癥失衡，大量免疫細胞如巨噬細胞、肥大細胞和B淋巴細胞等向脂肪組織聚集，炎性平衡遭到破壞，形成惡性循環[11]。隨著肥胖的進一步發展，脂肪組織以數量增多和體積增大為明顯變化，其中體積增大為主要特征。增大的脂肪細胞和氧氣供應比例失衡，導致脂肪組織的局部缺氧，HIF-1α和Glut-1蛋白水平增加[12]。研究發現，特異性敲除小鼠脂肪細胞HIF-1α會導致肥胖相關炎癥變化和胰島素抵抗[13]。除受低氧刺激外，HIF-1α轉錄也受其他因素的影響，而在脂肪組織中，HIF-1α與肥胖誘導的炎癥和胰島素抵抗有關[13]。

Kitade等[14]對 C57BL/6J以及 Ccr5-/-小鼠進行16周的高脂飲食發現，肥胖能夠通過Ccr5誘導脂肪組織招募巨噬細胞，使M1/M2分型發生改變。本研究通過對各組大鼠睪周脂肪細胞行HE染色，結果發現NC組存在明顯的巨噬細胞浸潤現象，細胞比較飽滿，體積較大且有融合成大細胞的趨勢，而4周的低氧運動可以減少巨噬細胞的浸潤，減小細胞體積，這種變化在HE組更為明顯。提示，低氧運動主要通過減小脂肪細胞的體積使內臟脂肪重量下降，進而降低脂肪體重比從而達到體重下降的效果。此外，通過HE染色也觀察到低氧復合運動的運動方式對巨噬細胞浸潤的改善優于單純運動或低氧。

3.2 低氧運動對脂肪組織缺氧的影響

HIF-1包含α和β亞基，常氧條件下二者穩定存在于各組織中，而在低氧和熱應力環境下，觀察到鮑魚腮部和血細胞中的HIF-1α含量明顯升高而HIF-1β表達相對穩定[15]。Glut-1是一種廣泛分布于人體細胞膜上的一種轉運體，主要功能是維持基礎狀態下組織細胞葡萄糖的攝取，對糖代謝起著重要的調節作用。但目前對Glut-1的研究主要集中在缺血、缺氧條件下的HIF-1α與Glut-1的變化。活化的HIF-1α使Glut-1表達過量，使葡萄糖攝取增加，有助于增加機體組織對缺血、缺氧等特殊環境的耐受性[16]。最近研究表明，低氧環境能夠顯著增加HIF-1α的表達，促進脂肪干細胞對葡萄糖的攝取，提高Glut-1和Glut-3的表達[17]，表明HIF-1α和Glut-1在能量代謝中起著重要作用。

本研究結果顯示，不管是常氧還是低氧，運動后脂肪組織HIF-1α蛋白表達明顯降低，這表明運動使IR的大鼠脂肪組織缺氧情況得到了顯著改善。并且，進行單純低氧干預也能明顯降低HIF-1α的蛋白表達，說明機體雖然處于低氧環境，但在此低氧條件下卻能夠顯著緩解因IR造成的缺氧狀態，可能是因為低氧提高了機體安靜狀態的代謝率，使脂肪細胞直徑減小，緩解了缺氧狀態，這也與黃徐根等[18]研究的結果一致。本實驗結果顯示，4周低氧運動干預后Glut-1的蛋白表達有下降的趨勢，且在低氧復合運動后表達顯著降低，表明在本實驗條件下，低氧運動對IR大鼠脂肪組織的葡萄糖代謝影響不明顯。考慮到Glut-1是HIF-1α的下游調控因子，這也與HIF-1α的表達一致，即低氧環境能刺激Glut-1的表達進而促進葡萄糖的攝取。之前實驗結果顯示4周的低氧運動干預能明顯改善IR大鼠對胰島素的敏感性從而促進葡萄糖轉運，但本實驗中Glut-1的表達并無顯著變化，這可能是由于低氧運動提高了Glut-1攝取葡萄糖的效率，使Glut-1表達量并無顯著增加因而導致本實驗結果。此外，由于Glut-1廣泛分布于機體各組織器官，通常與其他葡萄糖轉運體亞型共同承擔細胞的葡萄糖轉運[19]，另外一種可能是在本實驗中，Glut-1并不是主要改善IR大鼠對葡萄糖攝取的轉運蛋白。楊貴明等[20]對高脂飲食誘導IR大鼠進行4周的間歇性低氧暴露，發現間歇低氧結合運動能夠顯著改善IR大鼠的抗氧化能力，而運動可通過激活線粒體自噬進而改善機體能量代謝，緩解IR[21]。結合本實驗的研究結果，間歇低氧暴露改善大鼠的IR程度可能是由于改善了機體的抗氧化能力，增強了線粒體功能，清除了受損的線粒體，激活自噬，進而改善了IR程度。

間歇低氧運動可以通過刺激機體其他部位對糖的攝取、增強線粒體的功能進而提高了機體的有氧代謝，使IR大鼠體重下降，增強了胰島素敏感性，改善了IR程度。因此，為進一步闡明低氧與運動干預對IR的作用機制，一方面可從骨骼肌線粒體著手，觀察線粒體的生物合成和功能變化；另一方面可從脂肪組織的巨噬細胞入手，觀察兩種因素的干預對脂肪組織巨噬細胞分型和炎癥的影響，從而為運動改善IR提供理論依據。

4 結論

運動能夠有效降低IR大鼠的體重增長幅度，尤其是低氧運動能使大鼠體脂成分顯著下降。

低氧暴露并未加劇IR大鼠脂肪組織的缺氧狀況，反而能使體重降低，對脂肪組織的缺氧有改善作用。

常氧和低氧運動都能夠通過減小脂肪細胞直徑改善其缺氧狀況，但并未對脂肪組織Glut-1的表達產生影響。