與ADHD相關的外周循環microRNA芯片篩選及分析

朱 萍 潘 景 張 帆 吳麗慧

注意缺陷多動障礙(attention-deficit hyperactivity disorder，ADHD)是以注意力不集中、活動過度、沖動為特征的一種神經行為障礙，并伴有認知障礙和學習困難[1]。在全球兒童中的發生率約3%～5%，而60%～80%患兒的癥狀可持續至青少年或者成年，是兒童常見的神經精神障礙之一。目前ADHD的發病機制與病因比較復雜，還尚不明確，但多數研究者認為是遺傳因素與環境因素相互作用的結果，同時也與大腦結構與功能異常有關。ADHD的主要診斷依據美國精神病學會《精神障礙診斷與統計手冊》第5版(DSM-V)兒童ADHD臨床診斷標準，即問卷調查的方式[1]。目前還沒有可靠的分子診斷標記。

非編碼小RNA(microRNA, miRNA)通常源于1個大小約為1000bp的長鏈RNA初始轉錄產物(pri-miRNA)，pri-miRNA分子在細胞中經過雙鏈RNA特異性RNsae Ⅲ-drosha的作用下形成70～100nt具有莖環結構的前體microRNA (pre-miRNA)。Pre-miRNA在exportion-5的作用下轉運至胞質中，被另一個雙鏈RNA特異性RNsae Ⅲ-dicer識別，進一步切割成為成熟miRNA。miRNA與腫瘤、心血管疾病、糖尿病、人類遺傳性疾病甚至神經系統重大疾病的發生、發展密切相關。在中樞神經系統中miRNA含量特別豐富，其功能涉及神經發育、分化、退行性變、凋亡等，同時也涉及記憶、精神發育遲緩等方面，但miRNA在神經發育與活動中的作用還存在廣泛的未知性[2,3]。研究報道帕金森綜合征患者的血清中miR-133b，腦皮質組織中miR-205,表達量是顯著降低的；重度抑郁患者外周血中miR-132表達量增加，并且是通過結合在甲基-CpG結合蛋白(MeCP2)和腦源性神經營養因子(BDNF)的mRNA上的3′非翻譯區(3′UTR)，使MeCP2、BDNF表達下降，從而影響重度抑郁癥的發生、發展[4～6]。因此筆者猜測，和正常兒童比較，ADHD患兒外周循環中是否可能存在一組miRNA表達量有顯著性差異，這些改變的miRNA可能成為ADHD潛在的診斷標記，故本研究采用miRNA 芯片技術篩選出在ADHD患兒外周血清中差異表達的miRNA。

對象與方法

1.研究對象：實驗樣本來自2015年10月～2016年2月在筆者醫院就診的ADHD患兒20例，符合實驗標準的健康兒童60例。按照年齡和性別配對形成ADHD兒童∶正常兒童=1∶3的病例組20對。(1)病例組(ADHD)兒童納入標準：①6～18歲兒童；②根據美國精神病學會《精神障礙診斷與統計手冊》第5版(DSM-V)兒童ADHD臨床診斷標準，排除精神發育遲緩、品行障礙、情緒障礙、學習障礙及各種精神疾病等；③通過詳細的體格檢查、神經系統檢查、精神狀況檢查與相關實驗室輔助檢查，排除軀體疾病及神經系統疾病；④智商>70；⑤班主任綜合評定認為在語文和數學方面無明顯的學習困難，期末考試成績在全班平均成績減1個標準差以上；⑥近2周內未使用精神藥物治療。(2)對照組(非ADHD組)兒童的納入標準： 通過詳細的體格檢查、神經系統檢查、精神狀況檢查與相關實驗室輔助檢查，排除精神發育遲緩、品行障礙、情緒障礙、學習障礙及各種精神疾病，排除軀體疾病及神經系統疾病的健康兒童。該研究遵守《赫爾辛基宣言》，通過了筆者醫院醫學倫理學委員會批準。該研究的目的、方法、可能后果及健康保證均向兒童監護人交待清楚，所有監護人均簽署知情同意書。

2.標本收集：ADHD兒童和正常兒童采血前休息20～30min，通過肘靜脈采血4ml，室溫靜止1h，4℃ 10000r/min，離心10min，用取樣器將上清液(血清)吸取到無菌試管，血清標本儲存于-80℃冰箱。

3.microRNA 芯片篩選差異表達microRNA：所有樣本都用miRcute血清/血漿miRNA提取分離試劑盒(北京天根生化公司)抽提總RNA，使用美國Agilent公司人miRNA芯片V21.0(agilent human miRNA microarray V21.0)測試各組microRNA的表達量，該微陣列取自miRBase 21版數據庫，包含2549條人類miRNA的探針。每一張載玻片上包含8個單獨的微陣列，每個具有1900個功能。陣列包括48個陰性對照，用于估計熒光背景和背景差異，每個微陣列的樣品量為100ng，用Cy3標記后，每張載玻片經 XDR Scan (PMT100，PMT5)掃描得到信號。打開agilent scan control software掃描芯片獲得miRNA的信號圖像，用agilent feature extraction(AFE) software version 10.7.1.1分析可以得到所有的芯片和miRNA信號值。這些信號經消除背景后登陸SBC analysis system(http：//sas.ebioservice.com)進行統計分析。選擇hsa-miR-1273g-3p為內參，原因為，①在所有樣本內均有檢出；②標準差(SD)較小，在樣本間變化幅度小；③平均信號值較高，一般認為>30的信號值(log2后約為>5)相對更可靠，因此選用該內參進行校正。

4.實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR)驗證:(1)引物設計：對改變量>2倍的miRNA進行實時熒光定量PCR驗證，根據miRNA序列設計引物(引物由蘇州泓迅生物科技股份有限公司合成，miR-30d-5p反轉錄引物:5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTTCCA-3′，檢測引物:5′-GTTGTTGTAAACATCC-3′； miR-4655-3p反轉錄引物:5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCCCCG-G-3′，檢測引物:5′-TGTTGACCCTCGTCA-3′； miR-7641發轉錄引物:5′-GTCGTATCCAGTGC-AGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGCTTAG-3′，檢測引物:5′-CTCGTTTGATCTCGG-3′；內參miR-1273g-3p反轉錄引物:5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTCAG-GC-3′，檢測引物:5′-TCTAGTAACCACTGCACTC-3′，這4個miRNA在進行PCR檢測時均用miR-223a作為反向互補鏈5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′)。(2)RT：將抽提的血清總RNA通過反轉錄酶(M-MLV，日本TaKaRa公司)獲得cDNA. RT體系及條件為：先加樣Ⅰ體系(RNA 5μl，無菌水5μl，反轉錄引物1μl，內參引物1μl)混勻后，反應條件為70℃，10min,冰上5min；再加樣Ⅱ體系(5×RT buffer 4μl，10mol/L dNTP 1μl，無菌水2μl，M-MLV 1μl)混勻后，反應條件為30℃ 10min，42℃ 60min，70℃ 10min。(3)定量PCR: cDNA通過探針法實時監測PCR過程，最后用2-ΔΔCt法對基因表達進行相對定量。定量PCR體系及條件：2×Taqman Mix(CW0932S，康為世紀)5μl，引物(40μmol/L)0.0625μl+0.0626μl，通用探針0.125μl，無菌水3.25μl，cDNA1.5μl，反應條件95℃預變性10min，95℃ 15s,60℃ 1min。50個循環。

4.統計學方法：芯片結果選擇內參miR1273g-3p在所有樣本內的中位值為基準，將所有信號值減去該值。把對照組3個信號值取平均值后與ADHD患兒組進行配對T檢驗，實時熒光定量PCR結果也采用配對T檢驗分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.microRNA 芯片初篩結果:同對照組60例健康兒童比較，在年齡相仿、性別一致的情況下，ADHD患兒血清中miR-30d-5p、miR-19b-3p，miR-6085、miR-19b-3p、miR-6749-5p、miR-6826-5p、miR-3960等61個microRNA的表達量在20例ADHD患兒中均有改變(表1)。其中改變量>2倍即fold change<0.5的是 miR-30d-5p， miR-4655-3p和miR-7641，表1中前3個，這3個miRNA在各樣本中的信號值(圖1)，上方文本為樣本編號，左側文本為microRNA(探針)編號，每一行代表1個基因(探針)，每一列表示1個樣本。顏色越紅代表miRNA在對應樣本中的表達量越高，顏色越藍代表miRNA在對應樣本中的表達量越低。

表1 ADHD相關的外周循環microRNA芯片篩選

圖1 miR-30d-5p、miR-4655-3p、miR-7641熱圖

2.實時熒光定量PCR驗證：將實驗組(20例ADHD患兒)和對照組(60例健康兒童)的芯片結果表達量改變>2倍的miR-30d-5p、 miR-4655-3p和 miR-7641在上述80例樣本中進行實時熒光定量PCR驗證，結果顯示，和對照組比較，miR-30d-5p、 miR-4655-3p和 miR-7641在ADHD患兒外周血清中相對表達量降低(P=0.000)，與芯片篩選出的miRNA在ADHD中的表達趨勢一致(圖2)。

圖2 被篩選的miRNA在ADHD中的表達趨勢A.miRNA-30d-5p的相對表達量;B.miRNA-4655-3p的相對表達量;C.miRNA-7641的相對表達量

討 論

ADHD是兒童最常見的神經精神障礙之一，主要表現為注意力不集中、多動和沖動，可分為注意力缺陷型、多動/沖動型和混合型，發病可延續到成年。美國兒科學會(American Academy of Pediatrics，AAP)2011年版ADHD指南指出，初級保健醫生應當認識到ADHD是一種慢性狀態，有著特殊的保健需要，若沒有維持長期治療，將會造成很大影響。其原因在于其有發展為破壞和過度冒險行為，品行障礙，學習困難，情感問題的潛在風險，而這些非核心癥狀將影響到兒童各個方面如學業成就、成長及生活質量，給自身、學校、家庭和社會帶來極大負面影響[7]。迄今為止，ADHD的發病機制和病因未能完全清楚，大多數研究者認為中樞神經系統中多巴胺能、5-羥色胺能(5-HT)、去甲腎上腺素能的異常表達是ADHD的主要發病機制，而ADHD的主要診斷也是依據量表的形式，無分子診斷標記[8～10]。

miRNA參與控制許多細胞/分子過程，如細胞凋亡、增殖和分化[11, 12]。近年來，研究發現miRNA在中樞神經系統中含量特別豐富，其功能涉及神經發育、分化、退行性變、凋亡等，同時也涉及記憶、精神發育遲緩等方面。本課題組首先利用ADHD大鼠模型SHR和正常對照模型Wistar Kyoto(WKY)大鼠比較，測得SHR的腦前額區(PFC)存在半乳凝素3(Galectin-3)及miR-let-7d的表達異常，并且發現miR-let-7d直接作用于Galectin-3的3′UTR從而負性調控Galectin-3的表達，同時Galectin-3的降低能抑制TH的表達，而TH是多巴胺代謝過程的關鍵酶[13]。為此筆者進一步收集了35例ADHD患兒和35例門診體檢兒童，檢測到血清miR-let-7d的水平在ADHD組明顯高于對照組；在所收集到的ADHD患兒中，混合型占60%之多，因此推測miR-let-7d的高表達在混合型可能更加突出[14]。筆者還利用ADHD大鼠模型發現了和對照組WKY大鼠比較，SHR的前額皮質區域的miR-34c*、miR-138、miR-138*、miR-296和miR-494表達顯著下降，經過啟動子序列分析和活性測定，確定了糖皮質激素受體(Nr3c1)能夠使miR-34c *、miR-138-1、miR-296和miR-494基因的啟動子活性及其轉錄得到抑制。同時測得在SHR的PFC中，Nr3c1表達異常升高。另一方面，筆者還通過熒光素酶報告得到miR-34c*、miR-138、miR-138*、miR-296和miR-494能結合在轉錄因子Bhlhb2(Bhlhe40)信使RNA(mRNA)的3′非翻譯區上，從而抑制了Bhlhb2基因的表達。同樣地，Bhlhb2表達在ADHD模型SHR的PFC中也顯著高于對照。

為了進一步觀察Bhlhb2在SHR體內的作用，與對照組比較，敲除Bhlhb2基因能顯著改善SHR的活動過度[15]。這些研究結果表明，Nr3c1-Bhlhb2軸失調參與了注意力缺陷和多動癥的發展。結合本課題之前研究，認為存在一組miRNA在ADHD上是有表達差異的，筆者想從ADHD患兒獲得直接的證據。故本研究通過基因芯片技術，在年齡和性別一樣的條件下，ADHD患兒外周血清中有61個miRNA較正常兒童降低，取fold change>2倍的miR-30d-5p、miR-4655-3p、miR-7641進行實時熒光定量PCR驗證，趨勢同芯片結果一致。但是這些差異miRNA與ADHD之間的相互作用還有待進一步研究，有研究報道miR-30d-5p在阿爾茲海默癥患者外周血中表達量升高，并且與亨廷頓舞蹈病有關，目前還沒有研究miR-4655-3p與miR-7641在神經系統疾病的報道[16,17]。筆者猜測這些差異miRNA可能通過調控靶基因來影響ADHD的病情發展。

綜上所述，miR-30d-5p、miR-4655-3p和miR-7641在ADHD患者外周血清中降低明顯，因此認為這3個miRNA有可能作為臨床診斷ADHD的指標之一，但是由于本研究中樣本數量有限，后續實驗筆者將擴大樣本量，驗證結果的可靠性，以及差異miRNA是否會隨著ADHD病情好轉或者藥物治療后表達量改變，有待后續追蹤隨訪情況。同時筆者將著重于預測靶基因，查閱相關文獻分析靶基因功能，探討miRNA靶基因與ADHD之間可能存在的潛在關系。