微小RNA-664a-3p在乳腺癌組織的表達及對乳腺癌細胞生物學(xué)行為的影響

張 沛 岳青芬 侯青霞 韓聽鋒

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，中國乳腺癌發(fā)病人數(shù)僅次于美國，居全球第二位，且呈逐年上升趨勢[1, 2]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼RNA，長度約為19～25個核苷酸[3]。miRNA通過與靶基因mRNA的3′-UTR配對結(jié)合，導(dǎo)致靶基因mRNA降解或者抑制其翻譯，負向調(diào)控靶基因的表達[4]。miR-664a-3p的研究尚處于起步階段，目前僅發(fā)現(xiàn)miR-664a-3p在骨肉瘤細胞中具有腫瘤抑制作用[5]。本研究通過qPCR檢測miR-664a-3p在乳腺癌組織和細胞株的表達，并將miR-664a-3p轉(zhuǎn)染到乳腺癌細胞中，觀察miR-664a-3p對乳腺癌細胞增殖和侵襲的影響，探討其影響乳腺癌細胞生物學(xué)行為的分子機制。

材料與方法

1.實驗材料：(1)一般資料：經(jīng)筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會同意，患者本人或家屬簽署知情同意書，收集筆者醫(yī)院婦產(chǎn)科2017年1月～8月經(jīng)手術(shù)切除的新鮮乳腺癌組織標(biāo)本16例，所有患者在手術(shù)前均未行放射治療、化學(xué)治療等。取其乳腺癌原發(fā)腫瘤組織和癌旁組織(距離癌灶邊緣>5cm)標(biāo)本。經(jīng)病理學(xué)診斷證實所得標(biāo)本為乳腺癌組織，根據(jù)具體術(shù)中病理報告分為早期浸潤癌10例、浸潤癌6例。標(biāo)本術(shù)中取出后立即放入液氮中保存。(2)細胞與試劑：RNA提取試劑盒和熒光實時定量試劑盒購自日本TaKaRa公司。DMEM/F12 培養(yǎng)基、RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司。工具細胞HEK293、人乳腺癌細胞株(T47D、MDA-MB-231、BT-549、MCF-7)和正常乳腺上皮細胞MCF-10A購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。miR-664a-3p模擬物和miR-NC購自廣州市銳博生物科技有限公司。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000購自美國Invitrogen公司。pGL3熒光素酶檢測系統(tǒng)購自美國Promega公司。二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購自武漢博士德公司。一抗β-actin、TEM8、CDK4、Cyclin D1、Vimentin、β-catenin和辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗均購自美國Cell Signaling Technology公司。增強型化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。細胞周期檢測試劑盒購自中國凱基公司。Transwell小室購自美國Corning公司。

2.細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：在37°C、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，使用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)MCF-10A、T47D、MDA-MB-231和HEK293細胞，使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)BT-549和MCF-7細胞。將對數(shù)生長期的T47D細胞以每孔2×105個接種于6孔板。依據(jù)Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染濃度為50nmol/L。實驗細胞分兩組，即實驗組(轉(zhuǎn)染miR-664a-3p模擬物)和對照組(轉(zhuǎn)染miR-NC)。

3.熒光實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)檢測miR-664a-3p和靶基因mRNA表達：Trizol試劑提取總RNA，依據(jù)RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA，取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物qPCR反應(yīng)，擴增條件為94℃ 5min，94℃ 30s，60℃ 20s，72℃ 20s，共40個循環(huán)。使用2-△△Ct法計算miR-664a-3p相對于內(nèi)參U6的表達量及TEM8相對于內(nèi)參GAPDH的表達量。引物序列詳見表1。

4.生物信息學(xué)軟件預(yù)測miR-664a-3p靶基因及雙熒光素酶活性檢測：生物信息學(xué)軟件miRWalk、TarBase和TargetScan預(yù)測miR-664a-3p的靶基因并取交集，miR-664a-3p的靶基因可能為TEM8，互補結(jié)合序列詳見圖1。構(gòu)建野生型及突變型 TEM8-3′ UTR的報告基因質(zhì)粒，突變區(qū)域詳見圖1，并將野生型、突變型分別與miR-664a-3p和miR-NC共轉(zhuǎn)染入HEK293細胞中，48h后按照雙熒光素酶檢測試劑盒說明書，檢測各組螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性。以螢火蟲熒光強度/海腎熒光強度比值反映各組的相對熒光強度。

5.Western blot法檢測目的蛋白表達：分別使用細胞裂解液提取兩組細胞總蛋白。取25μg蛋白，行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)，電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂牛奶26℃封閉3h。一抗4℃孵育12h。Tris-HCl緩沖液漂洗2次，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗26℃孵育2h，Tris-HCl緩沖液漂洗2次，滴加增強型化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)發(fā)光顯影分析比較條帶變化。

6.流式細胞術(shù)(FCM)檢測細胞周期：將兩組細胞消化收集，使用磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗2次，加入1ml 70%乙醇溶液4℃固定1h，離心去上清，PBS溶液漂洗2次，加入1ml碘化丙啶(PI)試劑，26℃避光孵育30min，流式細胞儀檢測并分析各組細胞周期，以細胞所處細胞周期百分率表示。

7.CCK-8法檢測細胞活力：將兩組T47D細胞重懸后計數(shù)，每孔4000個接種于96孔板，每間隔24h每孔加入CCK-8試劑10μl，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4h，在酶標(biāo)儀450nm波長處測定吸光度(A)值，連續(xù)檢測5天，以時間為橫軸，A值為縱軸，繪制細胞生長曲線。每組實驗重復(fù)4次。

8.細胞侵襲實驗：Transwell侵襲小室上室面鋪以細胞外基質(zhì)(ECM)膠，培養(yǎng)箱內(nèi)放置4h使ECM膠凝固。將轉(zhuǎn)染后48h的兩組T47D細胞消化，使用無血清培養(yǎng)基重懸并計數(shù)，以2×104個/孔接種于上室，下室中加入500μl完全培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱內(nèi)孵育24h，吸取培養(yǎng)基，小室內(nèi)加入1ml甲醇固定20min，加入結(jié)晶紫溶液500μl染色20min，自來水清洗，棉簽擦去未穿過小室底膜的細胞，倒置顯微鏡下計數(shù)穿過小室底膜的細胞數(shù)目。

表1 qPCR引物序列

圖1 野生型TEM8 mRNA的3′-UTR區(qū)域含有miR-664a-3p靶向結(jié)合片段

結(jié) 果

1.miR-664a-3p在乳腺癌組織的表達：qPCR結(jié)果顯示(圖2)，miR-664a-3p在乳腺癌組織和癌旁組織的表達量分別為1.03±0.09、2.10±0.20，miR-664a-3p在乳腺癌組織中表達量顯著低于癌旁組織(t=4.83，P<0.01)。

圖2 qPCR檢測miR-664a-3p在乳腺癌及癌旁組織的表達量與癌旁組織比較，*P<0.01

2.miR-664a-3p在乳腺癌細胞株的表達：qPCR結(jié)果顯示，miR-664a-3p在乳腺癌細胞T47D、MDA-MB-231、BT-549、MCF-7的表達量明顯下調(diào)，其中在T47D細胞中的表達量最低，與正常乳腺上皮細胞MCF-10A及其他乳腺癌細胞株比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,圖3)。以T47D細胞為對象進行后續(xù)實驗。

圖3 qPCR檢測miR-664a-3p在乳腺癌細胞株及正常乳腺上皮細胞的表達量與正常乳腺上皮細胞，*P<0.05，**P<0.01

3.轉(zhuǎn)染miR-664a-3p對T47D細胞miR-664a-3p表達的影響：qPCR結(jié)果顯示，T47D細胞轉(zhuǎn)染miR-664a-3p后miR-664a-3p表達較對照組明顯增加(24.87±2.17 vs 1.02±0.10，t=10.96，P<0.01)。

4.熒光素酶報告基因?qū)嶒灒簾晒馑孛富钚詸z測結(jié)果顯示，miR-664a-3p可明顯抑制野生型 TEM8-3′ UTR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞的熒光素酶活性(P<0.01)，而對突變型TEM8-3′ UTR 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞的熒光素酶活性并無影響(圖4)。

圖4 熒光素酶報告基因驗證miR-664a-3p與TEM8-3′ UTR的靶向結(jié)合與“miR-NC+野生型質(zhì)粒”共轉(zhuǎn)染比較，*P<0.01

5.轉(zhuǎn)染miR-664a-3p對T47D細胞TEM8 mRNA表達的影響：qPCR結(jié)果顯示，T47D細胞轉(zhuǎn)染miR-664a-3p后TEM8 mRNA表達較對照組明顯下調(diào)(0.27±0.07 vs 1.00±0.01，t=9.97，P<0.01)。

6.轉(zhuǎn)染miR-664a-3p對T47D細胞TEM8相關(guān)蛋白表達的影響：Western blot法檢測結(jié)果顯示， T47D細胞轉(zhuǎn)染miR-664a-3p后TEM8、CDK4、Cyclin D1、Vimentin蛋白表達較對照組顯著下調(diào)，β-catenin蛋白表達較對照組顯著上調(diào)(圖5)。

圖5 Western blot法檢測miR-664a-3p轉(zhuǎn)染T47D細胞后目的蛋白的表達水平

7.轉(zhuǎn)染miR-664a-3p對T47D細胞周期的影響：流式細胞術(shù)結(jié)果顯示，T47D細胞轉(zhuǎn)染miR-664a-3p后在G0/G1期的細胞比例較對照組明顯上升，高表達miR-664a-3p可抑制T47D 細胞周期的進展(P<0.01，表2)。

8.轉(zhuǎn)染miR-664a-3p對T47D細胞增殖能力的影響：使用CCK-8連續(xù)5天檢測T47D細胞的生長，當(dāng)細胞生長至第4天和第5天，對照組細胞A值顯著高于實驗組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖6)。

9.轉(zhuǎn)染miR-664a-3p對T47D細胞侵襲能力影響：Transwell實驗結(jié)果顯示，在乳腺癌T47D細胞中高表達miR-664a-3p的細胞穿過小室底膜的細胞數(shù)明顯低于對照組(96.76±14.54 vs 217.50±17.96，t=5.22，P<0.01)。

表2 miR-664a-3p對乳腺癌細胞周期的影響

圖6 CCK-8 法檢測轉(zhuǎn)染miR-664a-3p后不同時點T47D細胞增殖能力的變化與對照組比較，*P<0.01

討 論

miRNA在轉(zhuǎn)錄水平對腫瘤細胞中的抑癌基因或癌基因的表達發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[6]。幾乎所有的腫瘤中均出現(xiàn)miRNA的異常表達，與腫瘤細胞的惡性生物學(xué)行為如增殖、侵襲轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[7]。miRNA的異常表達參與乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展。miR-320、miR-770、miR-361-5p等miRNA通過抑制癌基因的表達負向調(diào)控乳腺癌細胞的增殖或遷移、侵襲[8～10]。miR-421、miR-1246、miR-27a等miRNA可抑制抑癌基因的表達，促進乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲[11～13]。miR-664a-3p是miRNA家族的重要一員，可抑制骨肉瘤細胞的遷移和侵襲，然而其在乳腺癌中的作用目前尚不清楚[5]。

本研究結(jié)果顯示，miR-664a-3p在乳腺癌組織及乳腺癌細胞中低表達，提示miR-664a-3p可能與乳腺癌的發(fā)生、進展有一定的關(guān)系。生物信息學(xué)軟件分析顯示腫瘤內(nèi)皮標(biāo)志物8(TEM8)可能是miR-664a-3p的靶基因。以往的研究表明TEM8在腫瘤血管內(nèi)皮細胞中高表達，通過促進內(nèi)皮細胞的遷移進而利于腫瘤血管的生成，在腫瘤血管生成中發(fā)揮關(guān)鍵性作用[14]。近年來研究顯示，TEM8可促進腫瘤細胞的增殖和侵襲，在越來越多的腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[15]。有研究表明，TEM8在乳腺癌組織中高表達，其表達水平與患者的預(yù)后呈負相關(guān)[16]。本研究通過雙熒光素酶檢測實驗進一步驗證TEM8是miR-664a-3p的靶基因。本研究結(jié)果通過qPCR和Western blot法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達miR-664a-3p后TEM8 mRNA和蛋白的表達均明顯降低。細胞周期蛋白依賴性激酶4(CDK4)和細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)是正向調(diào)控細胞周期的重要蛋白。本研究顯示TEM8蛋白的下調(diào)引起CDK4和Cyclin D1蛋白表達降低。β-鏈蛋白(β-catenin)和波形蛋白(Vimentin)與腫瘤細胞遷移侵襲能力的變化密切相關(guān)，β-catenin蛋白的減少和Vimentin蛋白的增加均是腫瘤細胞遷移侵襲能力增強的表現(xiàn)。本研究顯示TEM8蛋白的下調(diào)引起β-catenin蛋白表達降低，Vimentin蛋白表達升高。本研究通過轉(zhuǎn)染miR-664a-3p至乳腺癌細胞T47D，發(fā)現(xiàn)T47D細胞周期進展明顯被抑制，細胞增殖能力和侵襲能力顯著降低，提示miR-664a-3p具有顯著的抑癌作用。

綜上所述，本研究表明miR-664a-3p在乳腺癌組織中處于高表達的狀態(tài)，通過抑制TEM8基因的表達，抑制細胞增殖能力和侵襲能力，在未來可能具有較好的臨床應(yīng)用價值，并可能成為乳腺癌潛在的腫瘤標(biāo)志物，用于乳腺癌的臨床診斷。