雙酚A對稀有鮈鯽胚胎及仔魚的急性毒性

周家輝，陳濤濤，李芹，史晉絨*，王永明

(1.內江師范學院 生命科學學院，四川 內江 641112； 2.上海海洋大學 水產與生命學院，上海 200120)

雙酚A(bisphenol A，BPA)屬雙酚類化合物，是一種內分泌干擾素，具有弱雌激素樣及強抗雄激素樣作用[1-4]。BPA可通過食品包裝材料進入食品或飲料中，從而進入人體。研究表明， BPA對人的皮膚、呼吸道、消化道和角膜等有中等強度刺激[1]，胎兒出生前低劑量的BPA暴露會改變體內的生物代謝途徑[5]。稀有鮈鯽(Gobiocyprisrarus)，俗稱金白娘、墨線魚，隸屬于鯉形目、鯉科、鮈鯽屬，為我國特有小型魚類，主要自然分布于四川漢源縣、都江堰市、彭州市等地[6]。稀有鮈鯽具有個體小、易飼養、對溫度和溶解氧等環境條件適應性強、不易染病、性成熟快、卵透明等優點[7]，是化學品毒性測試和環境水樣毒性試驗的理想材料[8]。

BPA作為一種內分泌干擾物，會對機體的內分泌系統造成一定影響，尤其會導致胎兒出現發育障礙和損傷[9]。BPA對魚類早期發育的影響有諸多報道，任文娟等[10]使用BPA及其衍生物對斑馬魚胚胎和幼魚進行暴露，結果顯示斑馬魚胚胎出現心包水腫、卵黃囊腫、脊柱彎曲和尾部彎曲等癥狀。楊麗華等[11]對BPA暴露下斑馬魚幼魚的神經行為進行了研究，斑馬魚幼魚的整體平均運動速率顯著降低。稀有鮈鯽作為一種理想的實驗魚類，目前尚無BPA對其早期發育影響的報道。本研究旨在為BPA對魚類早期發育階段的毒性效應提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用魚為本實驗室長期飼養的健康性成熟稀有鮈鯽，飼料(3081)購自正大集團，試驗用水為充氧飽和、24.3±0.3 ℃去離子水，配置25 mg·L-1BPA儲備液備用。

1.2 方法

1.2.1 飼養管理

選取實驗室內長期飼養的健康性成熟稀有鮈鯽作為親魚，以雌雄比1∶2飼養于實驗室內循環養殖系統中(水中溶解氧≥7 mg·L-1)，每日定時投喂飼料2次，外加豐年蟲1次，投喂15 min后及時吸去殘餌，水溫保持在(26.0±1.0)℃、pH值7.0，光照周期12 h/12 h(光照/黑暗)。通過晝夜節律控制，使稀有鮈鯽每日20:00左右產卵。當觀察到雄魚追逐雌魚，并用頭部頂撞雌魚腹部等產卵跡象時，將親魚撈出，人工干法授精獲取受精卵。受精卵一部分用于試驗，剩余部分用于測定受精率。

1.2.2 胚胎試驗

挑選形態正常、卵徑大小基本一致的胚魚卵進行試驗。根據預試驗結果，設置0、2、4、8、16 mg·L-1等5個濃度BPA處理組和1個酒精對照組，每個處理設3個平行。每個平行放入胚魚卵30粒，置于直徑12.0 cm、高2.0 cm有蓋培養皿中，(24.3±0.3)℃培養至受精后96 h。試驗期間及時剔除死亡個體，每隔24 h更換50%同濃度處理液，記錄胚胎死亡率、孵化率、心率等指標。參考文獻[12]，受精卵至肌肉效應期前，肉眼觀察到胚胎呈白色，即為死亡；肌肉效應期至出膜期，胚體停止擺動、心跳消失且半透明胚胎上有一系列不透光的污點出現，即為死亡。

1.2.3 仔魚試驗

根據預試驗結果，試驗設置0、2、4、6 mg·L-1等4個濃度BPA處理組和1個酒精對照組。將處理液加入培養皿中，每個培養皿放入10條孵化24 h發育正常、游動迅速的仔魚，每隔24 h觀察仔魚死亡率及形態學特征，試驗期96 h。卵黃囊期仔魚出現呼吸、心跳停止或缺乏機械刺激反應時，即為死亡。統計卵黃囊期仔魚水腫發生的嚴重程度，以水腫面積作為衡量標準。

1.2.4 統計分析

利用SPSS 19.0按照概率單位法計算處理試驗末期的半數致死濃度(LC50)，根據單因素方差分析法比較差異顯著性，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 BPA處理稀有鮈鯽胚胎和仔魚的半數致死濃度

如表1所示，隨著BPA濃度升高，稀有鮈鯽胚胎和仔魚的死亡率逐漸增加，BPA對稀有鮈鯽胚胎和仔魚的96 h半數致死濃度分別為10.096、4.237 mg·L-1。

表1 BPA處理稀有鮈鯽胚胎和仔魚的半數致死濃度

2.2 BPA對胚胎期稀有鮈鯽的毒性效應

BPA對稀有鮈鯽胚胎的毒性效應表現為胚胎孵化延遲、孵化率降低、心率不齊等，空白組和對照組胚胎發育正常(圖1)。

BPA暴露導致稀有鮈鯽胚胎心率降低、血液循環減慢。一定濃度范圍內，心率隨BPA濃度的升高而下降，16 mg·L-1BPA處理組心率顯著低于其他處理(表2)。BPA暴露導致胚胎孵化延遲甚至無法出膜，空白組胚胎在96 h內基本全部出膜，4 mg·L-1BPA處理組出膜率僅為8%，而8 mg·L-1BPA處理組出膜率為0，所有暴露組均顯著低于空白組。

表2 BPA對胚胎期稀有鮈鯽孵化率和 胚胎心率的影響

注：胚胎心率為處理36 h時測得。同列無相同字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.3 BPA對仔魚期稀有鮈鯽的毒性效應

BPA暴露導致稀有鮈鯽仔魚心包水腫，心率不齊，鰾形成率下降(圖2)。空白組仔魚發育正常無畸形，而BPA暴露組則出現了不同程度的畸變。

A，空白組仔魚心包和魚鰾(SB)發育正常；B，心包水腫(PCE)；C，魚鰾未充氣；D，心包水腫(PCE)、鰾未充氣圖2 BPA對仔魚期稀有鮈鯽的毒性效應

對BPA處理組仔魚的心包面積統計發現，心包水腫面積與劑量成正比，2 mg·L-1BPA處理組仔魚心包水腫面積與空白組無顯著性差異，而4、6 mg·L-1BPA處理組水腫面積顯著高于空白組(圖3)。BPA暴露顯著減弱仔魚的心臟搏動，仔魚心率隨BPA濃度升高而降低。隨著暴露時間增加，空白組仔魚心率先降低再升高，其他暴露組呈現下降趨勢。暴露72 h時，空白組和2 mg·L-1組全部仔魚魚鰾充氣，4、6 mg·L-1組魚鰾充氣率顯著低于空白組。

圖3 BPA對仔魚期稀有鮈鯽心包水腫面積、心率及魚鰾充氣率的影響

3 討論

BPA對魚類的毒性作用主要為內分泌干擾和生殖毒性[13-14]。高濃度的BPA暴露會引起胚胎和仔魚死亡，16 mg·L-1BPA處理組暴露96 h后稀有鮈鯽胚胎死亡率達到100%，8 mg·L-1BPA處理組暴露96 h后稀有鮈鯽仔魚死亡率達到100%。通過線性回歸方程分別求得胚胎和仔魚的半致死濃度為10.096、4.237 mg·L-1，說明仔魚期的稀有鮈鯽對BPA的毒性反應更敏感，這可能是因為胚胎期具有卵膜的保護，破膜而出的仔魚身體稚嫩，直接受到毒物侵蝕引起死亡。

孵化是魚類生命周期開始的關鍵，是一系列生物化學和物理學機制聯合作用的結果[15]。研究表明，水溫25.0 ℃條件下培育稀有鮈鯽胚胎34 h后，心臟發育完全，開始搏動，75 h孵化出仔魚[7]。本研究發現，BPA能夠延遲胚胎發育，表現出延遲發育的特征，可能是BPA影響了孵化酶的合成和釋放[13]。物質誘導的心率改變可被視為發育缺陷的表現[16]，無論胚胎還是仔魚，隨著BPA濃度升高，出現心跳減緩和心率不齊等癥狀。心包水腫的大小同樣是衡量心臟毒性的一個重要指標[17]，隨著BPA濃度升高和作用時間增加，心包水腫面積增加，表明BPA的暴露影響了心臟的正常生理功能。BPA暴露對胚胎期和仔魚期稀有鮈鯽的心臟均有毒性效應，造成心臟發育缺陷，影響血液循環，影響營養物質運輸，進而造成發育遲緩。

鰾能夠增加魚體的浮力，使魚在水中自由活動。已有研究表明，光照[18]、水體充氣量[19]、水表面的油膜[20]、鹽度[21]、溫度[22]等均可以引起仔魚鰾器官發育異常。本試驗中，BPA暴露72 h后，除空白組和2 mg·L-1BPA處理組外，其余BPA暴露組鰾充氣率均顯著降低。