吸煙對慢性阻塞性肺疾病小鼠肺部線粒體的影響

呂媛媛，王必斌，管敏鑫

(1.寧波李惠利醫院檢驗科，浙江 寧波 315040； 2.浙江大學醫學院附屬第一醫院檢驗科，浙江 杭州 310003； 3.溫州醫科大學 檢驗醫學院 生命科學學院，浙江 溫州 325035)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)是一種以持續氣流受限為特征的疾病，其病理特點是慢性氣道炎癥、肺氣腫，最終發展成不可逆的氣流阻塞[1]。COPD病因復雜，目前較為明確的病因主要有吸煙和空氣污染，隨著吸煙人群的增多和空氣污染的加重，預計到2020年，COPD將成為全球第三大死因[2-3]。香煙中含有4 800多種化合物，其中尼古丁、一氧化碳、氮氧化物、高濃度氧等成分可直接攻擊細胞，引起肺組織黏膜細胞損傷。線粒體是真核細胞中極為重要的細胞器，是細胞內氧化磷酸化和ATP合成的主要場所，線粒體DNA(mtDNA)缺少組蛋白保護和DNA修復系統，暴露于高濃度的活性氧狀態下容易受到損傷[4]。mtDNA數量和質量如果發生改變，可能引起線粒體功能障礙，直接影響細胞功能。本研究以C57BL/6小鼠為研究對象，構建煙熏COPD小鼠模型，研究吸煙對小鼠肺部線粒體數量和功能的影響，揭示線粒體損傷在COPD發生和發展中的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

6～8周齡SPF級C57BL/6小鼠，購自上海動物實驗中心，飼養在溫州醫科大學動物實驗中心。

1.1.2 試驗儀器

熏煙箱為自制玻璃箱，尺寸為70 cm×50 cm×50 cm；全自動組織切片機，德國Leica公司；熒光定量PCR儀，美國ABI公司；酶標儀，美國BioTek公司；Western blot電泳設備，美國Bio-Rad公司。

1.1.3 試劑耗材

大前門牌香煙，上海卷煙廠；SYBR?Green PCR Master試劑盒，美國ABI公司；抗鼠線粒體抗體(anti-ND5，anti-CO2，anti-VDAC)、二抗，英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 COPD小鼠模型建立

將30只小鼠隨機分為正常組和處理組，每組15只，飼養環境相同(溫度2l～26 ℃，濕度30%～70%)，自由飲食。根據文獻[5]方法對處理組小鼠進行煙霧暴露：每日煙熏2次，每次6支香煙，每次煙熏0.5 h，每周5 d，共煙熏3個月。

1.2.2 肺組織免疫組化

試驗3個月后，小鼠麻醉并頸動脈處死，取肺組織經4%甲醛固定、石蠟包埋后切片，采用SP三步法進行免疫組化[6]。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測肺組織細胞線粒體拷貝數

取小鼠肺組織3～5 g，勻漿，蛋白酶消化后用酚氯仿法直接提取小鼠細胞DNA，測定總DNA濃度。使用實時熒光定量PCR檢測肺組織細胞線粒體拷貝數。小鼠線粒體編碼的ND1正向引物為5′-CCCATTCTAATCGCCATAGC-3′，反向引物為5′-TAT GGCGTCTGCAAATGGTT-3′；小鼠核基因編碼的GAPDA基因作為內參，正向引物為5′-AAGGCTGTGGGCAAGG-3′，反向引物為5′-AAGGTGGAAGAGTGGGAGT-3′。按照試劑盒說明書進行檢測，DNA模板濃度為500 nmol·L-1，添加量1 μL。反應程序為：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s，60 ℃，34 s，共40個循環；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min；95 ℃，15 s。反映結束后，計算2-ΔΔCt值[7]，比較處理組和正常組mtDNA拷貝數(相對于核基因組)。

1.2.4 Western Blot檢測肺部細胞線粒體蛋白表達水平

取小鼠肺組織3～5 g，勻漿，加入500 μL RIPA裂解液裂解細胞，離心取上清，獲得蛋白溶液，BCA法測蛋白濃度。配制SDS-PAGE膠，蛋白上樣量為20～30 μg，電泳后轉至PVDF膜上，牛奶粉封閉2 h，孵一抗4 ℃過夜，次日孵二抗洗膜曝光。

1.2.5 數據統計分析

采用SPSS軟件對數據進行單因素方差分析及t檢驗，測定結果以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 吸煙對小鼠肺的損傷

如圖1所示，正常組小鼠肺組織肺泡壁結構連續、完整，肺泡間隔可見，煙熏處理組小鼠肺組織正常肺泡結構破壞，多個肺泡相互融合形成較大的肺大泡腔，與人類COPD患者肺組織形態結構相似，提示COPD小鼠模型構建成功。

A，正常組小鼠肺部；B，處理組小鼠肺部圖1 小鼠肺部病理切片(200×)

2.2 吸煙對小鼠肺部細胞線粒體DNA的影響

如圖2所示，處理組小鼠肺部細胞線粒體DNA拷貝數較正常組明顯下降。

圖2 熒光定量PCR結果

2.3 吸煙對小鼠肺部細胞線粒體蛋白合成功能的影響

ND5、CO2蛋白是線粒體呼吸鏈復合體I、IV中重要多肽成分，由線粒體DNA編碼。如圖3所示，處理組小鼠肺部細胞線粒體ND5、CO2蛋白表達水平相對于正常組分別下降了16.3%(P=0.007)和32.2%(P=0.06)。

圖3 Western Blot結果

3 討論

COPD是一種以氣流受限為特征的慢性炎癥性肺部疾病，病理生理特征復雜，發病機制尚未完全明了[8]。已有研究表明，吸煙是COPD的主要病因，約90%的COPD患者有吸煙史[9]。香煙煙霧中含有4 800多種化學物質，其中高濃度的ROS和親脂成分能夠通過細胞膜擴散至細胞內損傷線粒體[10]。線粒體呼吸鏈的正常運行不僅需要完整mtDNA分子結構，還需充分的mtDNA拷貝數。Liu等[11]研究發現，mtDNA拷貝數改變可能與肺癌的發生發展有關。Lee等[12]研究發現，50%肺癌患者mtDNA拷貝數增加，而23%患者mtDNA拷貝數下降。本研究結果顯示，煙熏組COPD小鼠肺部mtDNA拷貝數相對于正常組下降，表明吸煙可能通過降低肺部mtDNA數量，從而影響線粒體的功能。線粒體的氧化磷酸化過程主要通過內膜上的電子傳遞鏈復合物發揮作用，復合體I、II、III、IV和V是電子傳遞鏈的主要組成部分[13]。人類的mtDNA編碼線粒體呼吸鏈13個重要多肽，線粒體蛋白表達異常會導致線粒體功能障礙和細胞損傷[14]。Lv等[15]研究發現，mtDNA改變可影響線粒體蛋白的表達從而導致線粒體功能障礙。本研究發現吸煙會降低肺線粒體蛋白表達水平。

綜上所述，本研究通過構建煙熏COPD小鼠模型，分析mtDNA拷貝數及線粒體蛋白表達水平在煙熏COPD小鼠體內的變化，探討了線粒體損傷與COPD致病機制的相關性，本研究的發現為探索COPD的致病機制提供了新的視野和方向。由于COPD致病機制復雜多樣，其致病機制與線粒體的確切關系還有待于進一步的研究。