基于多重置換擴(kuò)增技術(shù)的胃癌患者胃內(nèi)微生物的宏基因組學(xué)研究

胡遠(yuǎn)亮，程乃嘉，張朝軍，黃 云，張 炎

中國(guó)是世界上胃癌患者最多的國(guó)家。據(jù)估計(jì)，2015年中國(guó)新發(fā)胃癌679 100例，有498 000人死于胃癌[1]。眾所周知，幽門(mén)螺旋桿菌(HelicobacterPylori,HP)慢性感染是胃癌發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素[2-3]，然而感染者中，只有不到1%的人最終發(fā)展成胃癌，提示胃癌的發(fā)生、發(fā)展還與其他因素相關(guān)。DNA測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)方法的發(fā)展使我們能夠不依賴傳統(tǒng)的培養(yǎng)手段而對(duì)人體微生物進(jìn)行研究，使得大量有關(guān)人體微生物組的研究涌現(xiàn)[4-5]。其中，有不少研究關(guān)注人體消化道微生物在胃部疾病中的作用。多項(xiàng)基于16S rRNA基因測(cè)序的研究已證實(shí)胃內(nèi)菌群構(gòu)成復(fù)雜，除HP外還有其他多種微生物存在，并且胃內(nèi)菌群失調(diào)與胃癌密切相關(guān)[6-9]。然而，對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因的分析很難精確到種的水平，而基于全基因組測(cè)序的宏基因組學(xué)方法可以在種甚至菌株水平上分析特定微生態(tài)系統(tǒng)中的菌群特征,從而能夠更加全面和深入地研究人體微生物和疾病的關(guān)系[4]。本研究通過(guò)多重置換擴(kuò)增技術(shù)(multiple displacement amplification,MDA)與宏基因組鳥(niǎo)槍法測(cè)序相結(jié)合的方法研究胃癌患者和健康受試者胃內(nèi)微生物的組成特征，從全基因組的角度探索胃菌群和胃癌的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 受試者篩選和標(biāo)本采集 胃癌組(GA)納入2017年9月—2017年12月在醫(yī)院就診并經(jīng)病理學(xué)證實(shí)的胃腺癌患者，納入者6個(gè)月內(nèi)未接受抗生素治療[10-12]，4周內(nèi)未使用質(zhì)子泵抑制劑或其他制酸劑，未接受術(shù)前放化療或內(nèi)鏡治療；同期納入無(wú)消化系統(tǒng)癥狀，且胃鏡檢查正常的來(lái)醫(yī)院查體人員作為健康對(duì)照組(HC)，入組標(biāo)準(zhǔn)同胃癌組。胃癌組共納入4例，年齡(60.4±6.5)歲；男女比例3∶1；健康對(duì)照組納入4例，年齡(53.2±5.3)歲；男女比例3∶1。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查并通過(guò)，受試者入組前簽署知情同意書(shū)。受試者空腹10 h后，于早上8∶30到10∶00之間在胃鏡檢查室行胃鏡檢查。待鏡頭完全進(jìn)入受試者胃中后，多部位吸取胃液至無(wú)菌容器，取樣完畢后立即將樣本置于冰上，并于0.5 h內(nèi)運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室處理。

1.2 標(biāo)本預(yù)處理 所有步驟均在層流的生物安全柜中進(jìn)行。將樣本轉(zhuǎn)移至50 mL離心管，用無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液稀釋樣本至50 mL，充分混勻后低溫低速離心10 min(400 r/min，4 ℃)。保留上清，棄去含有食物殘?jiān)腿梭w細(xì)胞的沉淀。上清用孔徑5 μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾，保留濾液，棄去濾膜(濾膜上有低速離心未分離出的人體細(xì)胞和食物殘?jiān)?，濾液再用0.22 μm濾膜過(guò)濾(此時(shí)細(xì)菌富集在0.22 μm孔徑濾膜上)，棄去濾液，保留濾膜。用滅菌剪刀把濾膜剪成0.5 cm×0.5 cm大小，置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用于DNA提取。經(jīng)過(guò)預(yù)處理，標(biāo)本中的人體細(xì)胞和食物殘?jiān)鹊玫接行コ瑢⒋蟠筇岣呒?xì)菌DNA提取的質(zhì)量，降低測(cè)序成本，并提高數(shù)據(jù)分析的準(zhǔn)確性。

1.3 DNA提取 采用MO-BIO PowerSoil DNA Isolation Kit對(duì)預(yù)處理后的濾膜碎片進(jìn)行DNA提取，該方法把化學(xué)裂解和珠磨結(jié)合起來(lái)，保證了細(xì)菌DNA提取效率。

1.4 DNA擴(kuò)增 采用MDA方法對(duì)提取DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間為6 h。

1.5 構(gòu)建測(cè)序文庫(kù) 用0.9倍DNA溶液體積的AMPure XP beads純化擴(kuò)增產(chǎn)物。使用Covaris S2超聲破碎儀打斷純化后的DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，選取程序DNA 300超聲破碎。片段化的DNA經(jīng)過(guò)0.9倍DNA體積的AMPure XP beads純化后，使用NEBNext ultra DNA library prep kit for Illumina試劑盒構(gòu)建DNA文庫(kù)。

1.6 文庫(kù)質(zhì)檢 建庫(kù)完畢后即送到北京大學(xué)生物光學(xué)動(dòng)態(tài)成像中心的測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行質(zhì)檢分析。

1.7 高通量測(cè)序 文庫(kù)質(zhì)檢完畢，即送到諾禾致源公司，使用Illumina HiSeq Xten測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行雙端PE150測(cè)序。

1.8 數(shù)據(jù)質(zhì)控 使用fastqc對(duì)測(cè)序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，用Trimmomatic[13]去接頭和低質(zhì)量序列,并結(jié)合bowtie2[14]比對(duì)工具去除原始數(shù)據(jù)中的宿主序列，保留高質(zhì)量的微生物DNA序列。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用MetaPhlAn2[15]對(duì)質(zhì)控后的數(shù)據(jù)進(jìn)行物種注釋，得到每個(gè)樣本的物種類別及物種相對(duì)豐度。應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，用R語(yǔ)言對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化。組間菌種數(shù)目比較采用Student’s t-test。使用STAM[16]軟件分析組間差異物種。比較組間優(yōu)勢(shì)物種相對(duì)豐度采用Mann-Whitney U test。以P<0.05為差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MDA能顯著放大提取的微量胃液微生物DNA 各樣本提取的微生物DNA總量分布于1～5 ng，難以達(dá)到構(gòu)建高質(zhì)量宏基因組測(cè)序文庫(kù)的要求。通過(guò)MDA擴(kuò)增，各個(gè)樣本的DNA顯著放大(207.27±33.17)倍，可以直接用于全基因組文庫(kù)的構(gòu)建。為了提高擴(kuò)增效果的可比性，每個(gè)DNA樣本的擴(kuò)增起始量均為1 ng(表1)。

表1 MDA能顯著擴(kuò)增各樣本的微量微生物DNA

注：GA1-4和HC1-4分別代表胃癌組和健康對(duì)照組樣本

2.2 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估 樣本的數(shù)據(jù)量、Q20值、Q30值、測(cè)序錯(cuò)誤率以及GC含量相關(guān)數(shù)據(jù)具體見(jiàn)表2。所有樣本測(cè)序平均通量為3.28G，Q30值均大于91%，測(cè)序錯(cuò)誤率均低于0.02%，可見(jiàn)測(cè)序質(zhì)量較好。

表2 全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.3 組間微生物組成的整體分布 經(jīng)測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)控，去除低質(zhì)量序列和宿主序列，得到高質(zhì)量的微生物DNA序列。用MetaPhlAn2對(duì)質(zhì)控后的數(shù)據(jù)進(jìn)行物種注釋，得到各樣本物種組成及物種相對(duì)豐度。所有樣本共鑒定出131個(gè)菌種,胃癌患者胃內(nèi)菌群多樣性明顯低于健康受試者(Student’s t-test，P<0.01，t=4.189,圖1)。在細(xì)菌門(mén)水平，受試者胃液菌群主要由變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、梭桿菌門(mén)組成(圖2)。同時(shí)，HC組中HP的平均相對(duì)豐度高于GA組(14.19%±22.25% vs 32.05%±28.24%)，但差異比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Mann-Whitney U test，P=0.383,Z=0.871)。

圖1 胃內(nèi)菌群多樣性(菌種數(shù)目)比較

圖2 細(xì)菌門(mén)分類水平各樣本的物種相對(duì)豐度堆疊柱狀圖

2.4 組間顯著差異的菌種 為了比較組間優(yōu)勢(shì)物種的差異，我們篩選出各個(gè)樣本中相對(duì)豐度大于1%的優(yōu)勢(shì)物種，菌種相對(duì)豐度(%)經(jīng)Log2變換，使用STAMP軟件對(duì)組間優(yōu)勢(shì)物種進(jìn)行分析。我們發(fā)現(xiàn)牙髓卟啉單胞菌、口腔鏈球菌、干燥奈瑟菌在GA組中的相對(duì)豐度明顯高于HC組(Mann-Whitney U test，P<0.05，W=10.0，圖3)。

圖3 組間顯著差異的菌種

3 討論

DNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展使我們能不依賴于傳統(tǒng)的培養(yǎng)手段而對(duì)人體內(nèi)大量無(wú)法培養(yǎng)的微生物進(jìn)行研究，不斷更新著我們對(duì)人體微生物的認(rèn)識(shí)[4]。人體內(nèi)細(xì)菌的數(shù)目大約與人體細(xì)胞的數(shù)目相當(dāng)，且主要集中在消化道[17]。它們與人類共進(jìn)化，在人體的生長(zhǎng)發(fā)育、穩(wěn)態(tài)維持和疾病的發(fā)生、發(fā)展中都扮演著至關(guān)重要的角色，包括癌癥[18-20]。其中，HP感染已被證實(shí)是患胃癌的主要危險(xiǎn)因素[2-3]。同時(shí)，多項(xiàng)研究也表明除HP外的胃內(nèi)其他細(xì)菌也和胃癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[6-7,9]。然而以往的研究大多基于對(duì)細(xì)菌16S rRNA基因的分析，使用全基因組鳥(niǎo)槍法測(cè)序?qū)ξ赴┗颊呶竷?nèi)菌群的研究微乎其微[21]。本研究使用MDA技術(shù)擴(kuò)增從胃液中提取的微量細(xì)菌DNA，并用擴(kuò)增產(chǎn)物構(gòu)建了高質(zhì)量的測(cè)序文庫(kù)，用于高通量測(cè)序，得到了高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，從很大程度上證實(shí)了全基因組擴(kuò)增的方法用于人體胃內(nèi)微生物組研究的可行性。

以往的研究主要把MDA用于擴(kuò)增真核細(xì)胞基因組，特別是用于單細(xì)胞測(cè)序[22-23]。也有不少學(xué)者把MDA用于擴(kuò)增成分已知的微生物基因組，并對(duì)其擴(kuò)增的覆蓋度和均勻度進(jìn)行評(píng)估[24-25]。還有一些研究把細(xì)菌分選技術(shù)與MDA技術(shù)結(jié)合起來(lái)，以求得到某種或某些細(xì)菌的全部基因組序列[26-27]。這些研究都證明了MDA用于擴(kuò)增DNA的可靠性和有效性。然而，很少有學(xué)者將MDA用于擴(kuò)增復(fù)雜微生物樣品中的DNA。雖然我們未進(jìn)一步對(duì)擴(kuò)增覆蓋度和均勻度進(jìn)行驗(yàn)證，但初步的分析結(jié)果證實(shí)通過(guò)該方法可以從微量的DNA中檢測(cè)到大量精確定位到種的微生物，證明了該方法用于胃內(nèi)微量微生物檢測(cè)的可行性。

不少基于對(duì)胃黏膜細(xì)菌16S rRNA基因的研究發(fā)現(xiàn)，胃癌患者的HP感染率和/或HP相對(duì)豐度要低于正常人和/或淺表性胃炎患者[7,28]。可能原因是HP慢性感染導(dǎo)致胃酸分泌減少，從而使其他本不適應(yīng)酸性環(huán)境的細(xì)菌能夠在胃內(nèi)更好存活，而又反過(guò)來(lái)影響HP自身在胃內(nèi)的定植[29-30]。本研究收集的8個(gè)樣本中，4名健康人的胃液均檢測(cè)到不同豐度的HP序列，而4名胃癌患者有3名存在HP感染，且健康對(duì)照組中HP的平均相對(duì)豐度高于胃癌組，從一定程度上反映了胃癌患者HP感染率下降的趨勢(shì)，與之前的研究相符。然而，HP序列相對(duì)豐度在8名受試者中差異較大(23.12±26.95)，提示HP攜帶者個(gè)體之間感染程度差異較大。在抗生素耐藥越來(lái)越嚴(yán)重的今天，這種個(gè)體之間感染程度的巨大差異也許對(duì)HP感染控制策略的個(gè)體化制定有一定指導(dǎo)意義。

我們從所有樣本中一共鑒定出131種細(xì)菌，并發(fā)現(xiàn)與健康對(duì)照組比較，牙髓卟啉單胞菌、口腔鏈球菌、干燥奈瑟菌在胃癌組中富集。牙髓卟啉單胞菌和口腔鏈球菌是人體口腔內(nèi)的共生菌，而干燥奈瑟菌主要定植于上呼吸道黏膜，它們?cè)谖赴┦茉囌呶敢褐写罅看嬖冢蔡崾疚赴┗颊呶竷?nèi)微環(huán)境的變化可能允許來(lái)自身體其他部位的特定細(xì)菌在胃內(nèi)定植，但這種定植與胃部疾病的因果關(guān)系有待進(jìn)一步研究。我們還發(fā)現(xiàn)胃癌患者胃液內(nèi)菌種多樣性顯著低于健康對(duì)照組，這與之前對(duì)胃黏膜菌群的研究一致[6-7]。本研究樣本量較少，盡管樣本采集和數(shù)據(jù)分析均采用統(tǒng)一的方法，但只有通過(guò)更大樣本量的研究和多人群的驗(yàn)證才能進(jìn)一步排除混雜和隨機(jī)因素，得到更加肯定的結(jié)論。

總之，我們首次把MDA和宏基因組鳥(niǎo)槍法測(cè)序結(jié)合起來(lái)研究胃癌患者胃內(nèi)菌群的特征，證實(shí)了該方法的可行性。該方法可用于從菌種甚至菌株的水平上研究與胃癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的微生物，并可用于微量病原體的檢測(cè)。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)特定菌種在胃癌患者胃液內(nèi)富集，提示其作為胃癌生物學(xué)標(biāo)志物的潛在價(jià)值。在以后的研究中納入更多受試者，涉及更廣的人群，進(jìn)一步證實(shí)該方法的可靠性，并探索菌群與胃癌發(fā)生、發(fā)展的因果關(guān)系。