賴氨酸特異性脫甲基酶2B及B細胞淋巴瘤-2蛋白、Hrk蛋白在卵巢癌組織中的表達情況及其臨床意義▲

易葉葉 況 燕 蒙家華 楊慧蘭 徐 紅 侯海瑞

(廣西醫科大學第一附屬醫院婦產科，南寧市 530021，電子郵箱：1036240289@qq.com)

卵巢癌的病死率居女性惡性腫瘤的首位，預后不良，嚴重威脅著許多女性的生命健康[1-2]。由于其早期臨床癥狀不明顯或與其他良性婦科疾病癥狀相似，大部分卵巢癌患者出現臨床癥狀時其腫瘤已轉移到腹膜表面，就診時已處于疾病晚期，治療難度大,易復發,預后差。盡管目前臨床上針對卵巢癌的治療方法不斷改進,患者的總生存期仍然很差，5年生存率無明顯改善[3]。因此,探索卵巢癌的發病機制,開發新的腫瘤診斷標志物，有利于卵巢癌的早期診斷和治療。本研究采用免疫組化法分析組蛋白去甲基化酶—賴氨酸特異性脫甲基酶2B[lysine(K)-specific demethylase 2B,KDM2B]、凋亡抑制基因蛋白B細胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)，以及促進凋亡基因蛋白-Hrk蛋白在卵巢癌中的表達情況，并其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2016年12月至2018年9月在我院進行診治的100例卵巢疾病患者的卵巢組織標本，包括20例正常卵巢組織(來源于子宮肌瘤或子宮腺肌病并行全子宮雙附件切除術的患者)，30例良性卵巢腫瘤(13例漿液性囊腺瘤和17例黏液性囊腺瘤)，42例上皮性卵巢癌(25例漿液性腺癌、10例黏液腺癌、6例子宮內膜樣癌和1例鱗狀細胞癌)，8例非上皮性卵巢癌(5例未成熟畸胎瘤、2例肉瘤及1例卵黃囊瘤)。所有病例在取材前均未接受放、化療及免疫治療，且均經組織病理學檢查確診。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2 主要試劑 兔抗人KDM2B多克隆抗體(批號：ab85807)購自CST公司，兔抗人Bcl-2蛋白單克隆抗體購自博士德公司(批號：A00040-1)，兔抗人Hrk蛋白多克隆抗體(批號：ab45419)購自Abcam公司；鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶(streptavidin-perosidase，SP)試劑盒(批號：PV-6001)和二氨基聯苯胺顯色試劑盒(批號：ZLI-9018)購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 檢測方法 應用免疫組化SP法檢測不同卵巢組織中KDM2B、Bcl-2蛋白、Hrk蛋白的表達情況,具體實驗步驟嚴格按照試劑說明書進行，其中KDM2B、Bcl-2蛋白、Hrk蛋白抗體工作液濃度分別為1 ∶500、1 ∶100、1 ∶50,以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對照,以已知陽性切片作為陽性對照。最后在顯微鏡下觀察結果。

1.4 結果判定標準 采用Volm雙評分法[4]進行結果判定，陽性定義為在胞核或胞質內出現棕黃褐色顆粒，其著色強度明顯高于背景非特異性染色。從400倍高倍鏡下，每張切片均隨機取5個視野,每個視野根據陽性細胞比例和染色強度計分。陽性細胞的百分比計分：<25%為1分，25%～<50%為2分，50%～75%為3分，>75%為4分。染色程度計分:不著色計0分,淡黃色計1分,棕黃色計2分,棕褐色計3分。把兩者分數相乘作為最終判定結果:0分為陰性(-),1～2分為弱陽性(+),3～4分為中度陽性(++),≥5分為強陽性(+++)。其中(+)、(++)、(+++)均為陽性表達。

1.5 統計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。計數資料以例數(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗；采用Spearman相關系數進行相關性分析。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同卵巢組織中KDM2B、Bcl-2蛋白及Hrk蛋白的陽性表達情況 惡性卵巢腫瘤的KDM2B、Bcl-2蛋白陽性表達率明顯高于良性卵巢腫瘤組織及正常卵巢組織(均P<0.05),惡性卵巢腫瘤組織、良性卵巢腫瘤組織、正常卵巢組織的Hrk蛋白陽性表達率依次升高(均P<0.05)，見表1及圖1。

表1 不同卵巢組織中KDM2B、Bcl-2蛋白及Hrk蛋白陽性表達情況比較[n(%)]

注：與正常卵巢組織比較，*P<0.05；與良性卵巢腫瘤組織比較，#P<0.05。

圖1 不同卵巢組織中KDM2B、Bcl-2蛋白及Hrk蛋白表達情況(SP法，×400)

注：1A、1B、1C分別為正常卵巢組織、良性卵巢腫瘤組織、惡性卵巢腫瘤組織中KDM2B的表達；2A、2B、2C分別為正常卵巢組織、良性卵巢腫瘤組織、惡性卵巢腫瘤組織中Bcl-2蛋白的表達；3A、3B、3C分別為正常卵巢組織、良性卵巢腫瘤組織、惡性卵巢腫瘤組織中Hrk蛋白的表達。

2.2 KDM2B、Bcl-2蛋白及Hrk蛋白表達情況與惡性卵巢組織臨床病理學特征的關系 低分化、國際婦產科聯合會(International Federation of Gynecology and Obstetrics,FIGO)分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結轉移病例的KDM2B及Bcl-2蛋白陽性表達率均分別高于中-高分化、FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移病例(均P<0.05)，而Hrk蛋白陽性表達率均分別低于中-高分化、FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移病例(均P<0.05)。不同年齡段病例的3種蛋白陽性表達率比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)。見表2～4。

表2 KDM2B表達情況與惡性卵巢腫瘤患者臨床病理學特征的關系

表3 Bcl-2蛋白表達與惡性卵巢腫瘤患者臨床病理學特征的關系

表4 Hrk蛋白表達與卵巢癌腫瘤患者臨床病理學特征的關系

2.3 惡性卵巢腫瘤組織中KDM2B、Bcl-2蛋白表達與Hrk蛋白表達的相關性 在惡性卵巢癌腫瘤組織中，KDM2B、Bcl-2蛋白的陽性表達率均與Hrk蛋白的陽性表達率呈負相關(rs=-0.581,P=0.023；rs=-0.341,P=0.008)。

3 討 論

組蛋白去甲基化酶KDM2B也稱為NDY1、JHDM1B或FBXL10，屬于JHDM家族。由KDM2B基因編碼的蛋白質包含含有Jumonji C結構域、富含半胱氨酸結構域、植物同源結構域，富含脯氨酸的區域和富含亮氨酸的重復序列。其中，Jumonji C結構域是催化H3K36me2和H3K4me3去甲基化的活性中心，并且可以通過其含鋅指結構的半胱氨酸區域與CpG島結合[5-6]。KDM2B在調節細胞生長、增殖、衰老、凋亡、核糖體RNA表達及造血干細胞自我更新等多方面發揮重要作用[7-8]；其在多種惡性腫瘤中表達異常,被認為是一種致癌基因[9-11]。Zhao等[9]發現KDM2B在胃癌細胞中高表達,敲低KDM2B表達能抑制胃癌細胞生長和增殖；Tzatsos等[10]發現KDM2B在胰腺導管腺癌中高表達，且其表達水平與腫瘤分級及轉移有關，沉默KDM2B能消除胰腺導管腺癌細胞的致瘤性。以上結果均提示KDM2B可能參與多種腫瘤的發生發展過程。本研究結果顯示，惡性卵巢腫瘤組織的KDM2B陽性表達率明顯高于良性卵巢腫瘤組織及正常卵巢組織(均P<0.05)，且低分化、FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴結轉移的惡性卵巢腫瘤病例的KDM2B陽性表達率均分別高于中-高分化、FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期、無淋巴結轉移病例(均P<0.05)，這與Kuang等[11]的研究結果相似。這提示KDM2B也可能與卵巢癌的發生發展有關。

Bcl-2蛋白是調節細胞凋亡的Bcl-2蛋白家族的創始成員，Bcl-2蛋白家族可以分為兩大類:Bcl-2蛋白類,是抑制凋亡因子；Bcl-2蛋白相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)類,是促進凋亡因子[12-13]。目前，已有研究表明Bcl-2蛋白基因的損傷導致了多種惡性腫瘤的發生，包括乳腺癌、前列腺癌和肺癌等[14-16]。有學者發現，Bcl-2蛋白在鱗狀細胞癌組織中呈高表達，其陽性表達率與腫瘤組織學分化程度、TNM分期、浸潤深度及淋巴結轉移密切相關[17]。有研究證實，miR-16通過下調Bcl-2蛋白的表達,抑制細胞活性和遷移能力,誘導胃癌細胞凋亡[18]。本研究結果顯示，Bcl-2蛋白在惡性卵巢腫瘤組織中的陽性表達率高于良性卵巢腫瘤組織及正常卵巢組織(P<0.05),且Bcl-2蛋白的表達陽性率隨著惡性卵巢腫瘤組織分級及FIGO分期的增加而升高(P<0.05)，存在淋巴結轉移者Bcl-2蛋白的陽性表達率增高(P<0.05)。這提示Bcl-2蛋白與卵巢癌的發生有一定的關系。

Hrk蛋白屬于凋亡相關蛋白BH3亞家族成員。有研究表明，BH3亞家族成員均可促進細胞凋亡，起到腫瘤抑制因子的作用，Hrk蛋白通過BH3結構域與Bcl-2蛋白或Bcl-xL結合，形成異二聚體活化Bax，最終誘導細胞凋亡[19-20]。有學者報道，Hrk蛋白在乳腺癌中低表達，其表達水平與乳腺癌高病理分級和低臨床分期有關，七失神同源物1可通過上調Hrk蛋白表達來促進乳腺癌細胞凋亡,在乳腺癌形成中發揮重要作用[20]。研究表明，Hrk蛋白表達上調能促進前列腺癌和卵巢癌細胞凋亡[21-22]。另有研究顯示，Hrk蛋白在胃癌組織中表達水平低于癌旁組織，可能參與調控胃癌的發生發展[23]。本研究結果顯示，Hrk蛋白在惡性卵巢腫瘤組織中的陽性表達率低于良性卵巢腫瘤組織及正常卵巢組織(P<0.05),且Hrk蛋白陽性表達率隨著惡性卵巢腫瘤組織分級及FIGO分期的增加而降低(P<0.05)，存在淋巴結轉移者Hrk蛋白的陽性表達率較低(P<0.05)。提示Hrk蛋白表達下調可能在卵巢發生發展的過程中發揮一定作用。

Wang等[24]對多形性成膠質細胞瘤進行研究后發現，沉默KDM2B的表達后Hrk蛋白的表達增加，這初步說明 KDM2B能調控Hrk蛋白的表達。而本研究結果也顯示，在惡性卵巢腫瘤組織中KDM2B與Hrk蛋白的陽性表達率呈負相關(P<0.05)。而Hrk蛋白是三甲基化組蛋白H3賴氨酸27的直接靶基因,其在腫瘤中的低表達與其本身DNA甲基化有關，此外KDM2B能促進組蛋白H3賴氨酸27的三甲基化[23，25-26]。由此，我們推測KDM2B可能通過促進H3K27三甲基化進而調節Hrk蛋白的表達，從而在腫瘤發生發展中起重要作用。Hrk蛋白直接作用的分子主要有Bcl-2蛋白家族和Bcl-xL。Hrk蛋白通過BH3結構域與Bcl-2蛋白或Bcl-xL結合誘導細胞凋亡，是一種促凋亡蛋白[19-20]。有研究顯示Bcl-2蛋白與Hrk蛋白蛋白在胃癌組織中的表達呈負相關，Bcl-2蛋白抗凋亡基因作用受到Hrk蛋白促凋亡蛋白影響，二者之間有相互促進作用[23]。本研究結果也顯示，在惡性卵巢腫瘤組織中Bcl-2蛋白與Hrk蛋白的陽性表達率呈負相關(P<0.05)。因此，我們推測Bcl-2蛋白與Hrk蛋白共同參與了卵巢癌的發生、發展。

綜上所述,卵巢癌中KDM2B與Bcl-2蛋白的表達上調，Hrk蛋白的表達下調，三者可能通過不同的方式參與卵巢癌的發生發展。這可能成為卵巢癌轉歸及判斷預后的參考指標，為臨床的靶向治療提供新思路。