結(jié)縷草高效再生體系的建立

趙俊俠，陳 耕，夏桂先，胡曉麗，潘轉(zhuǎn)霞，許愛玲，皇甫張龍，張換樣，李朋波

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，山西運城044000；2.中國科學(xué)院微生物研究所，北京100080）

隨我國城市綠化進(jìn)程的不斷加快，城鎮(zhèn)的花園化和草坪事業(yè)有了很大發(fā)展。結(jié)縷草是禾本科結(jié)縷草屬植物，屬多年生草本，是暖季型草種，極耐踐踏，具有抗病、無蟲害等優(yōu)點。用結(jié)縷草密植可構(gòu)筑成人工草地，組成園林綠化地，供人們觀賞、游憩或作為運動場地。草坪具有調(diào)節(jié)濕度和溫度、降低空氣污染、減少城市噪音、防止水土流失等功能。但草坪業(yè)在發(fā)展中存在兩大問題：一是草坪越冬困難，青綠期較短，枯黃期長；二是草坪養(yǎng)護(hù)需要大量的淡水。也就是說，解決草坪草抗凍性及抗旱性問題為草坪業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵。目前，最行之有效的方法就是盡快選育具有抗凍及抗旱特性的草坪草新品種。因此，培育耐寒、耐旱、綠色期長的結(jié)縷草新品種具有重要意義。隨生物技術(shù)的發(fā)展，利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)（將抗凍、抗旱基因?qū)氩萜翰荩色@得優(yōu)質(zhì)的草坪草種質(zhì)資源）培育優(yōu)質(zhì)抗逆的草坪草新品種具有一定的優(yōu)勢。要獲得結(jié)縷草的轉(zhuǎn)基因再生植株，先必須通過植物細(xì)胞的組織培養(yǎng)建立起結(jié)縷草的再生體系。

本試驗對草坪草結(jié)縷草的細(xì)胞培養(yǎng)及植株再生進(jìn)行了研究，旨在利用現(xiàn)代生物技術(shù)，建立高效的植株再生體系，為下一步利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改造結(jié)縷草，建立草坪草的遺傳轉(zhuǎn)化體系、獲得轉(zhuǎn)基因植株、培育轉(zhuǎn)基因草坪草奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 結(jié)縷草草種由中國科學(xué)院微生物研究所提供。種子經(jīng)過70%酒精浸泡2 min，再放入0.1%HgCl2中消毒15～20 min，然后用無菌水沖洗5～6 次，用吸管吸出草籽，將其置于有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，封口，28 ℃培養(yǎng)20 d 后可獲得愈傷組織。

1.1.2 培養(yǎng)基

1.1.2.1 誘導(dǎo)培養(yǎng)基 根據(jù)前期棉花和水稻在組織培養(yǎng)中的不同特性和試驗結(jié)果[1]，誘導(dǎo)培養(yǎng)基是獲得愈傷組織及植株再生的關(guān)鍵，本試驗誘導(dǎo)培養(yǎng)基選擇NB 改良培養(yǎng)基和MS 改良培養(yǎng)基。其中，NB改良培養(yǎng)基：N6培養(yǎng)基的大量元素＋B5培養(yǎng)基的微量元素＋B5培養(yǎng)基的有機(jī)成分＋蔗糖30 g/L＋水解酪蛋白500 g/L，pH 值5.8。MS 改良培養(yǎng)基：MS培養(yǎng)基的大量元素＋MS 培養(yǎng)基的微量元素＋MS有機(jī)成分＋蔗糖30 g/L，pH 值5.8。愈傷組織誘導(dǎo)時每種培養(yǎng)基中分別添加2，4 mg/L 的2，4-D。

1.1.2.2 分化培養(yǎng)基 分化培養(yǎng)基以MS 培養(yǎng)基為主，并在部分培養(yǎng)基中添加水解酪蛋白，觀察添加生物蛋白提取物對胚性愈傷組織的形成是否有促進(jìn)作用。分化培養(yǎng)基為：MS 培養(yǎng)基＋KT 0.1 mg/L；MS 培養(yǎng)基＋KT 0.1 mg/L＋水解酪蛋白500 g/L。

1.1.2.3 生根培養(yǎng)基 生根培養(yǎng)基為MS 培養(yǎng)基＋I(xiàn)AA 0.2 mg/L＋NAA 0.1 mg/L。

1.2 試驗方法

將消毒處理過的結(jié)縷草種子接種到含有不同激素組合的MS 和NB 培養(yǎng)基上，分別進(jìn)行光培養(yǎng)和暗培養(yǎng)，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)。光培養(yǎng)是將材料置于日光燈照射下培養(yǎng)，光照強(qiáng)度2 000 lx，培養(yǎng)溫度28 ℃；暗培養(yǎng)是將材料置于暗箱中培養(yǎng)，直到愈傷組織分化，產(chǎn)生幼苗為止，培養(yǎng)溫度28 ℃。經(jīng)過30～40 d 培養(yǎng)，種子上可見小的愈傷組織突起，7 d后將其小心剝下，便可得到塊狀愈傷組織；經(jīng)2～3 代繼代培養(yǎng)，從擴(kuò)增后的愈傷組織中挑選表面光滑、乳白色、呈顆粒狀的部分，轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基上；21 d 后，愈傷組織表面可見一層細(xì)的白色絨毛生成，產(chǎn)生胚性愈傷組織；然后再經(jīng)過8～10 d 的培養(yǎng)開始分化，呈現(xiàn)許多綠色斑點，繼而發(fā)育形成小突起，之后會見到點狀生長點和微細(xì)的根出現(xiàn)；培養(yǎng)7 d 后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基，經(jīng)過20 d 培養(yǎng)，可獲得完整的再生植株。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基添加不同濃度激素對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

對結(jié)縷草種子進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，可得到不同的愈傷組織出愈率（表1）。由表1 可知，MS＋2 mg/L 2，4-D 培養(yǎng)基處理215 粒種子，得到58 塊愈傷組織，出愈率為27%；MS＋4 mg/L 2，4-D 培養(yǎng)基處理210 粒種子，得到46 塊愈傷組織，出愈率為22%；NB＋2 mg/L 2，4-D 培養(yǎng)基處理180 粒種子，得到56 塊愈傷組織，出愈率為31%；NB＋4 mg/L 2，4-D培養(yǎng)基處理208 粒種子，得到47 塊愈傷組織，出愈率為23%。結(jié)果表明，在結(jié)縷草的愈傷組織誘導(dǎo)中，MS 和NB 培養(yǎng)基在相同誘導(dǎo)條件下，即相同激素濃度下，愈傷組織誘導(dǎo)率差別不大。而在同一培養(yǎng)基中，不同激素組合間，愈傷組織誘導(dǎo)存在一定差別[2]，2 mg/L 2，4-D 組合優(yōu)于4 mg/L 2，4-D 組合。表明在愈傷組織的形成和發(fā)育中，2 mg/L是2，4-D 較為合適的添加濃度。這與張樹錄[3]對禾本科植物組織培養(yǎng)、王景雪等[4]對玉米胚葉再生植株的研究結(jié)果一致。

表1 結(jié)縷草的愈傷組織出愈率

2.2 胚性愈傷組織的產(chǎn)生

在結(jié)縷草愈傷組織的誘導(dǎo)階段，MS 培養(yǎng)基和NB 培養(yǎng)基在相同誘導(dǎo)條件下，愈傷組織的誘導(dǎo)率差別不大；但在其愈傷組織的分化階段，即胚性愈傷形成時，MS 培養(yǎng)基卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于NB 培養(yǎng)基。在MS 培養(yǎng)基上進(jìn)行分化時，愈傷組織有60%～70%能產(chǎn)生胚性愈傷并得到再生植株；而在NB 培養(yǎng)基上進(jìn)行分化時，愈傷組織全部變成綠色的硬塊狀，并伴隨許多毛狀根生成，最終卻不能得到再生植株。MS 培養(yǎng)基非常適合結(jié)縷草愈傷組織分化，并形成胚性愈傷，最終生成再生植株，NB 培養(yǎng)基基本不能使結(jié)縷草愈傷組織分化。參考多種植物不同的組織培養(yǎng)試驗可知，與其他培養(yǎng)基相比，MS 培養(yǎng)基顯著特點是硝酸鹽、鉀和銨含量高，其硝酸鉀和磷酸二氫鉀的終濃度分別為1 900，170 mg/L，是目前普遍使用的培養(yǎng)基。它有較高的無機(jī)鹽濃度，對保證組織生長所需的礦質(zhì)營養(yǎng)和加速愈傷組織的生長十分有利。由于配方中的離子濃度高，在配制、貯存、消毒等過程中，即使有些成分略有出入，也不至于影響離子間的平衡。MS 固體培養(yǎng)基可用來誘導(dǎo)愈傷組織，或用于胚、莖段、莖尖及花藥培養(yǎng)，其液體培養(yǎng)基用于細(xì)胞懸浮培養(yǎng)時能獲得明顯成功。這種培養(yǎng)基中的無機(jī)養(yǎng)分的數(shù)量和比例比較合適，足以滿足植物細(xì)胞在營養(yǎng)上和生理上的需要，具有較高的無機(jī)鹽濃度，能夠保證組織生長所需的礦質(zhì)營養(yǎng)，還能加速愈傷組織的生長。而NB 培養(yǎng)基基本成分中硝酸鉀和磷酸二氫鉀的含量較MS 培養(yǎng)基有大幅度提高，其終濃度分別為2 830，400 mg/L。研究表明，二者對胚的誘導(dǎo)在不同植物上有不同表現(xiàn)，MS 培養(yǎng)基上表現(xiàn)好的有大豆胚[5]、早熟蘋果胚、矮紅花幼胚、荔枝胚、甘薯[6]、棉花胚狀體[7]等；NB 培養(yǎng)基上表現(xiàn)好的有水稻[8]、大麥胚[9]等。

試驗結(jié)果表明，在添加水解酪蛋白的培養(yǎng)基上，結(jié)縷草的分化均明顯好于不添加水解酪蛋白的培養(yǎng)基。添加某些植物提取有機(jī)物，有助于植物愈傷組織的分化，形成胚性愈傷。KENT 等[10]報道，添加牛奶番茄汁能促進(jìn)大麥未成熟胚的生長；GONZALEZ 等[11]研究認(rèn)為，加入10%椰子汁有利于洋蔥胚的拯救；PRZYWARA 等[12]在培養(yǎng)三葉草雜合胚胚珠時，在培養(yǎng)基中添加15%黃瓜汁效果很好；李寶平等[13]研究表明，在培養(yǎng)基中添加20 mL/L 椰子乳有利于芫荽胚的生長。原因可能有2 個，一是由于這些提取物中含有一些能促進(jìn)植物細(xì)胞分化生長的微量因子，對植物胚形成和發(fā)育具有明顯的促進(jìn)作用；二是對培養(yǎng)物供應(yīng)足夠的氨基酸態(tài)氮是誘導(dǎo)胚狀體發(fā)生的重要條件。

2.3 不同光照條件對愈傷組織分化和植株再生的影響

在結(jié)縷草愈傷組織的誘導(dǎo)階段，光培養(yǎng)和暗培養(yǎng)條件下愈傷組織的誘導(dǎo)率差別不大。但在其分化階段，暗培養(yǎng)條件下，愈傷組織通過分化成胚性愈傷組織[14-17]，經(jīng)體細(xì)胞發(fā)生途徑產(chǎn)生再生植株的數(shù)量大大高于光培養(yǎng)條件下愈傷組織的分化。由表2可知，暗培養(yǎng)條件下，愈傷組織的分化率為55%，植株再生率為47%；光培養(yǎng)條件下，愈傷組織的分化為10%，植株再生率為7%。光對于某些植物胚胎的生長具有很大影響，主要表現(xiàn)在光能抑制未成熟胚的早期萌發(fā)。從表2 還可看出，光培養(yǎng)條件下，12 塊分化的愈傷組織得到9 株再生植株，再生率為75%；暗培養(yǎng)條件下，68 塊分化的愈傷組織得到58 株再生植株，再生率為85%。說明在結(jié)縷草的培養(yǎng)中，分化后胚性愈傷組織的植株再生率是相當(dāng)高的。對于結(jié)縷草的組織培養(yǎng)及植株再生體系的建立，暗培養(yǎng)模式優(yōu)于光培養(yǎng)模式。

表2 不同光照條件對愈傷組織分化的影響

3 結(jié)論

植物體外再生技術(shù)，包括器官發(fā)生和體胚發(fā)生，是生物技術(shù)研究的前提。建立高效的結(jié)縷草高效再生體系，是利用基因工程將外源基因?qū)肫渲仓辏@得具抗逆性狀的再生植株的重要基礎(chǔ)。結(jié)縷草和草坪草，用原生質(zhì)體進(jìn)行轉(zhuǎn)化，其過程比較繁瑣復(fù)雜，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法以轉(zhuǎn)化方法簡便、成本較低等特點在草種的基因轉(zhuǎn)化中應(yīng)用較為廣泛。本試驗通過對MS 培養(yǎng)基和NB 培養(yǎng)基稍加改進(jìn)，使結(jié)縷草愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)到27%；在分化培養(yǎng)基中添加酪蛋白水解物，在暗培養(yǎng)條件下，愈傷組織的分化率達(dá)到55%，植株再生率達(dá)到47%，建立了一套完整的植株再生體系，為下一步將耐旱、抗凍等外源基因?qū)虢Y(jié)縷草，獲得優(yōu)質(zhì)的草坪草種質(zhì)資源奠定了基礎(chǔ)。