波形蛋白、鋅指蛋白在非小細胞肺癌組織中的表達變化及其相互關系

俞立萍，鄧周峰，萬劍慧，林宏堅

(上海市同仁醫院，上海200336)

流行病學研究顯示，非小細胞肺癌(NSCLC)發病率可達273～483/10萬，特別是近3年其發病率上升趨勢明顯[1，2]。不同腫瘤相關蛋白的表達，均能影響肺泡上皮細胞的生物學特征，促進惡性腫瘤的發生和病情進展。研究發現，波形蛋白(Vimentin)主要表達于上皮組織和基底膜組織中，能促進上皮細胞間的縫隙連接和緊密連接的分解，可影響上皮細胞的極性和形態[3]；鋅指蛋白(Slug蛋白)表達能通過促進上皮細胞間質成分的分解，提高腫瘤細胞的黏附和侵襲能力[4，5]。為深入探討Vimentin、Slug蛋白表達與NSCLC發生發展的關系，本研究檢測了Vimentin、Slug蛋白在NSCLC組織中的表達變化，并分析二者的相互關系。現報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2015年1月～2017年8月上海市同仁醫院手術治療的NSCLC患者，本研究獲得醫院醫學倫理委員會批準。納入標準：①符合2014年NCCN指南中NSCLC診斷標準；②術后經病理學或纖維支氣管鏡取活組織證實；③術前未行放化療或免疫治療；④術中留取腫瘤組織或者癌旁組織；⑤患者或家屬知情并簽署知情同意書。排除標準：①轉移性肺癌；②長期使用免疫抑制劑等藥物；③HIV感染。共選取90例患者的NSCLC病理標本組織(NSCLC組)及其中45例患者的癌旁組織(對照組)。NSCLC組患者中男53例、女37例，年齡(56.2±9.6)歲，鱗癌10例、腺癌80例，腫瘤分化程度為高分化26例、中分化30例、低分化34例，TNM分期Ⅰ期27例、Ⅱ期38例、Ⅲ期22例、Ⅳ期3例，發生淋巴結轉移51例。對照組患者中男28例、女17例，年齡(58.0±10.3)歲，鱗癌5例、腺癌40例，腫瘤分化程度為高分化10例、中分化18例、低分化17例，TNM分期Ⅰ期15例、Ⅱ期20例、Ⅲ期8例、Ⅳ期2例，發生淋巴結轉移27例。兩組性別、年齡等臨床資料具有可比性。

1.2 Vimentin、Slug蛋白檢測方法 采用免疫組化法。取石蠟標本進行連續性切片，脫蠟至水；采用H2O2室溫下孵育10 min，磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3～5 min；加8%的蛋白粉封閉液(BSA，南京博奧生物科技公司)，封閉2 h；倒去封閉液后加入一抗(兔源，濃度1∶1 000～1∶1 500)，4 ℃冰箱過夜；磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3～5 min。加入二抗(鼠源，1∶400～1∶500)，室溫孵育20～30 min；磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3～5 min。加入辣根酶或堿性磷酸酶標記物，室溫孵育10 min；磷酸鹽緩沖液沖洗3次，每次3～5 min；滴加顯色劑(DAB，南京博奧生物科技公司)，復染，脫水，封片。染色分析的結果判定：Vimentin蛋白主要分布于細胞質中、Slug蛋白主要分布于細胞核或細胞質，兩種蛋白陽性染色在顯微鏡下均表現為黃色、棕黃色甚至褐色。依據染色強度評分：無染色為0分、淡黃色為1分、棕黃色為2分、褐色甚至更深為3分；依據陽性染色細胞比例評分：≤10%為1分、11%～50%為2分、51%～75%為3分、>75%為4分。染色強度與染色陽性細胞比例評分相乘，≥3判為陽性表達。

1.3 統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件。計數資料以例或率表示，組間比較行χ2檢驗，相關關系行Spearman秩相關分析法。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組Vimentin、Slug蛋白陽性表達情況比較 NSCLC組Vimentin、Slug蛋白陽性表達率分別為57.78%(52/90)、68.89%(62/90)，對照組分別為8.89%(4/45)、13.33%(6/45)，NSCLC組Vimentin、Slug蛋白陽性表達率均高于對照組(χ2=29.539、37.039，P均<0.05)。

2.2 NSCLC組不同病理特征NSCLC組織中Vimentin、Slug蛋白表達比較 TNM分期Ⅲ期和Ⅳ期、發生淋巴結轉移的NSCLC組織中Vimentin蛋白陽性表達率高于TNM分期Ⅰ期和Ⅱ期、未發生淋巴結轉移的NSCLC組織(P均<0.05)，TNM分期Ⅲ期和Ⅳ期、發生淋巴結轉移、低分化NSCLC組織中Slug蛋白陽性表達率高于TNM分期Ⅰ期和Ⅱ期、未發生淋巴結轉移、高分化及中分化的NSCLC組織(P均<0.05)。見表1。

表1 NSCLC組不同病理特征NSCLC組織中Vimentin、Slug蛋白表達比較

2.3 NSCLC組Vimentin蛋白、Slug蛋白表達的關系 相關分析顯示，NSCLC組中Vimentin蛋白與Slug蛋白表達呈正相關(r=0.640，P<0.05)。

3 討論

環境、遺傳等因素均能誘導NSCLC的發生，促進NSCLC臨床病理特征的進展。作為呼吸系統常見的惡性腫瘤，NSCLC無瘤生存時間不足38個月，包括手術在內的相關綜合性治療后的3年病死率仍>35%[6,7]。另外，現階段臨床上缺乏對于NSCLC早期診斷的有效生物學血清分子，也是導致患者生存期較短的主要原因。本研究觀察了Vimentin、Slug蛋白在NSCLC組織中的表達變化，旨在探討NSCLC的發生機制，為NSCLC的免疫靶向治療提供基礎，為NSCLC早期高危人群的血清學篩查提供依據。

研究發現，某些生物學因子的濃度波動，能夠在促進腫瘤細胞的早期核異型性發生，或中晚期臨床病理特征進展過程中發揮重要作用。其能夠調控腫瘤細胞的生物學特性，干預腫瘤細胞的擴散和轉移速率等，進而影響到患者的整體生存預后。Vimentin表達能夠促進細胞間連接蛋白的分解，降低了上皮細胞間的黏附能力[8,9]。Vimentin對于腫瘤細胞微絲和微管蛋白的激活作用，能夠提高上皮細胞的變形和浸潤能力。近年來基礎方面的相關研究還認為，Vimentin是重要的信號通路激活因子，其對于HIPPO信號通路的激活作用，能夠提高NSCLC上皮細胞核DNA的轉錄風險，增加腫瘤細胞的調控異常風險[10]。Slug蛋白能夠參與到上皮-間質轉化過程，其對于腫瘤細胞間質成分的分解作用，能夠為腫瘤細胞浸潤基底膜組織提供前提；Slug蛋白表達還能提高腫瘤細胞對于基底膜內皮細胞的黏附能力，增強腫瘤細胞對內皮下血管的浸潤能力[11]。

本研究結果顯示，Vimentin、Slug蛋白在NSCLC患者病灶組織中陽性表達率均較癌旁組織上升，提示Vimentin、Slug蛋白高表達均能影響NSCLC的發生過程。通過分析相關文獻，我們認為這與Vimentin、Slug蛋白以下的病理生理作用機制有關[12～14]：①Vimentin蛋白表達上升能夠提高腫瘤細胞肌動蛋白的活性，提高腫瘤細胞侵襲和轉移能力；②Slug蛋白表達上升能夠提高惡性腫瘤上皮-間質轉化的速度，促進腫瘤細胞對于基底膜的浸潤過程。岳銀艷等[15]也發現，在NSCLC患者腫瘤組織中，Slug蛋白陽性表達率明顯上升，平均升幅超過25%，在發生遠處轉移或臨床分期進展的患者中Slug蛋白表達上升更明顯。相關分析可見，Vimentin、Slug蛋白表達具有內在的正相關關系，提示二者在促進NSCLC病情進展過程中可能發揮一定的協同作用。這主要與Vimentin、Slug蛋白表達均能夠影響到腫瘤細胞的浸潤能力，促進了上皮-間質轉化過程有關。對NSCLC患者臨床病理特征的分析研究可見，在臨床分期較晚或發生淋巴結轉移的患者中，Vimentin蛋白陽性表達率明上升，提示Vimentin蛋白表達對NSCLC患者臨床病程有影響。這主要與Vimentin蛋白表達上升能夠促進腫瘤細胞對臨近正常肺部組織的浸潤，增加了腫瘤細胞對于淋巴結內皮細胞的黏附過程有關。而在臨床分期較晚、發生了淋巴結轉移或者腫瘤細胞分化程度較差的患者中，Slug蛋白表達也上升，表明Slug蛋白表達與NSCLC的臨床病理特征有關系。這主要與Slug蛋白表達不僅能影響到腫瘤細胞浸潤基底膜組織的能力，同時還能夠影響到肺泡上皮細胞的分化成熟能力。由此可見，在NSCLC患者中，Vimentin、Slug蛋白表達均上升，二者與肺癌患者的臨床病理特征的進展密切相關，在促進肺癌的發生發展中起到一定的協同作用。因此，Vimentin、Slug蛋白可用于NSCLC的診斷、病情判斷，作為治療靶點亦有一定臨床價值。