二甲雙胍對2型糖尿病大鼠膽汁酸代謝FXR-MAFG-CYP8B1信號通路的影響

李萌思雨，胡曉文，徐業秋，胡曉琳，張春雪，逄曙光,

(1 濟南大學 山東省醫學科學院醫學與生命科學學院，濟南250013；2 山東大學附屬濟南市中心醫院)

2型糖尿病(T2DM)主要表現為糖脂代謝紊亂，膽汁酸(BA)作為糖脂代謝的重要信號分子，其主要通過BA受體(FXR)介導的多種信號通路發揮重要的生理作用[1]。BA既是肝臟膽固醇分解代謝的主要途徑，又能促進腸道膳食脂肪的吸收。BA激活FXR后，可抑制甾醇調節元件結合蛋白的表達，進而改變脂類代謝相關基因的表達；能夠誘導過氧化物酶體增殖物激活受體α的表達，進而促進脂肪酸氧化[2]；還能夠降低磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶和葡萄糖-6-磷酸酶的表達，從而抑制糖異生[3]。膽固醇通過經典途徑和替代途徑合成BA。經典途徑是BA合成的主要途徑，合成大約等量的膽酸(CA)和脫氧膽酸(CDCA)；膽固醇7α羥化酶(CYP7A1)是經典途徑的限速酶，而膽固醇12α羥化酶(CYP8B1)可以催化CDCA向CA轉化[4]。最近研究表明，V-Maf肌肉腱膜纖維肉瘤癌基因同源物G(MAFG)是FXR的靶標，是BA合成和代謝的關鍵轉錄抑制因子[5]。研究顯示MAFG降低肝臟中CYP8B1的轉錄水平[5，6]。由此可見，FXR-MAFG-CYP8B1信號通路在BA代謝中具有重要作用。研究發現，糖尿病大鼠的BA池增大，而胰島素治療能夠降低BA池的大小、抑制CYP7A1、CYP8B1活性，并改變BA的組成[7]。二甲雙胍可以降糖降脂，該作用是否通過影響BA代謝發揮作用尚未可知。2017年12月～2018年10月，我們觀察了二甲雙胍對T2DM大鼠FXR-MAFG-CYP8B1信號通路的影響，從膽汁代謝通路探討其治療糖尿病的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑 60只雄性Wistar大鼠，8周齡，體質量200～250 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；將動物于(23±2)℃、12 h光照/黑暗循環環境下常規喂養，實驗操作符合實驗動物倫理委員會要求。FXR抗體購自Biorbyp公司；CYP8B1、MAFG抗體購自Abcam公司；PVDF膜(0.2 mm)、ECL檢測試劑盒購自Millipore公司；鏈脲佐菌素(STZ)購自Sigma公司；鹽酸二甲雙胍購自中美上海施貴寶制藥有限公司；CA ELISA試劑盒購自上海通蔚生物有限公司；TRIzol、RNA抽屜試劑、反轉錄反應和實時熒光定量PCR反應試劑盒購自TaKaRa公司。血糖儀、Cobas8000自動生化分析儀購自羅氏公司；胰島素ELISA試劑盒購自Mercodia公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與造模干預 將60只大鼠適應性喂養1周后，隨機分為3組各20只。對照組喂食標準飲食(6%脂肪，64%碳水化合物,23%蛋白質)，模型組、干擾組喂食高脂飲食(25%脂肪，48%碳水化合物，20%蛋白質)。喂養10周后，模型組、干擾組腹腔注射小劑量STZ 30 mg/kg誘導T2DM模型，對照組腹腔注射等量生理鹽水。STZ注射后72 h，模型組、干擾組用血糖儀測量空腹血糖(FBG)≥11.1 mmol/L，成功建立T2DM模型。干預組給予二甲雙胍500 mg/(kg·d)灌胃，其余兩組給予等量生理鹽水灌胃，連續干預12周。

1.2.2 一般情況觀察及標本收集 每天早晨觀察大鼠精神狀態，記錄并計算32周齡時與入組時食物攝入量、水攝入量和體質量變化。在32周齡時禁食過夜，眶后靜脈叢取血，分離血清后-80 ℃冰箱保存；脫頸處死后剖腹取出肝組織，置于液氮中冷凍。

1.2.3 血清糖脂代謝指標及BA檢測 取靜脈血清，使用Cobas8000自動生化分析儀檢測總膽固醇(TC)、總甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、BA，用血糖儀測FBG，用ELISA試劑盒檢測空腹胰島素(FINS)。胰島素抵抗指數(HOMA-IR)=[FBG(mmol/L)×FINS(μU/mL)]/22.5。

1.2.4 肝組織FXR、MAFG、CYP8B1 mRNA檢測 采用實時熒光定量PCR法。使用TRIzol試劑提取肝臟總RNA，在紫外分光光度計下讀取A260/A280值。用TaKaRa兩步法反轉錄試劑盒將RNA樣品反轉錄為cDNA，按照PCR反應液配比說明書配成20 μL反應體系。反應條件：預變性95 ℃ 30 s；PCR反應95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，共40個循環；解離95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。反應中所用引物序列:FXR正向5′-AAGTGACCTCCACGACCAAG-3′，反向5′-TGGCATTCTCTGTTTGCTGT-3′；MAFG正向5′-CCCAATAAAGGAAACAAGGCC-3′，反向5′-GCACCGACATGGTCACCA-3′；CYP8B1正向5′-TCCATATGTCCCGGCAGGTTCTTT-3′，反向5′-TGTCAGGGTCCACCAGTTCAAAGT-3′；β-actin正向5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA -3′，反向5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′。每組設3個復孔，以β-actin為內參，采用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。

1.2.5 肝組織FXR、MAFG、CYP8B1蛋白檢測 采用Western blotting法。制備大鼠肝臟勻漿，4 ℃下以10 000 r/min離心10 min；收集上清液，BCA測定總蛋白質濃度。加入4×上樣緩沖液(蛋白質與蛋白質上樣緩沖液比例為4∶1)，將混合物在100 ℃水中煮沸8 min。將等量蛋白質加載至12% SDS-PAGE上，再轉移到PVDF膜上。將膜在PBST/5%脫脂奶粉中封閉，4 ℃下與針對FXR、MAFG、CYP8B1、β-actin的一抗孵育過夜。用磷酸鹽緩沖液和0.05% Tween-20(PBST)洗滌后，將與HRP綴合的二抗于室溫下孵育4 min。去除二抗后，使用ECL試劑盒洗滌印跡，在自動凝膠成像分析系統上成像。以Image J圖像處理軟件計算目的蛋白與內參光密度比值，以此表示目的蛋白的相對表達量。

1.2.6 肝組織CA檢測 采用ELISA法。稱取1 g肝組織樣品，加入9 g PBS(pH 7.2～7.4)并攪勻。以2 000～3 000 r/min離心20 min，收集上清液。將一部分包裝進行測試，其余部分冷凍備用。用ELISA試劑盒檢測CA，按說明書操作。

2 結果

2.1 各組大鼠一般狀況比較 實驗過程中，對照組一般狀態好，飲食、飲水、體質量無明顯改變；模型組消瘦，毛色雜亂，精神萎靡，飲食、飲水量增加；干擾組給予二甲雙胍干預后癥狀較模型組好轉。與對照組比較，模型組和干擾組體質量減輕，飲食和飲水增加(P均<0.05)；與模型組比較，干擾組二甲雙胍治療后體質量、飲食和飲水均減少(P均<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠體質量、飲食、飲水變化

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

2.2 各組血清糖脂代謝指標及BA水平比較 與對照組比較，模型組FBG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C、BA水平均升高而HDL-C水平降低(P均<0.05)。與模型組比較，干擾組FBG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C、BA水平均降低而HDL-C水平升高(P均<0.05)。見表2。

表2 各組血清糖脂代謝指標及BA水平比較

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

2.3 各組肝組織FXR、MAFG、CYP8B1 mRNA及蛋白表達比較 與對照組比較，模型組肝組織FXR、MAFG表達下調而CYP8B1表達上調(P均<0.05)；與模型組比較，干擾組肝組織FXR、MAFG表達上調而CYP8B1表達下調(P均<0.05)。見表3。

2.4 各組肝組織CA比較 對照組、模型組、干擾組肝組織CA分別為(442.58±86.18)、(1 208.90±127.21)、(620.98±35.48)ng/mL，模型組>干擾組>對照組(P均<0.05)。

表3 各組肝組織FXR、MAFG、CYP8B1表達比較

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

3 討論

T2DM是與血脂異常和胰島素抵抗相關的炎性疾病。在本研究中，我們通過給予高脂飲食喂養和小劑量STZ注射建立了T2DM大鼠模型。據報道，高脂飲食喂養引起胰島素抵抗，STZ對胰島β細胞有毒性作用。當注射大劑量STZ時，可破壞大多數胰島β細胞以誘導T1DM模型；而注射小劑量STZ可用于制備T2DM模型，表現出血糖升高及胰島素抵抗[8]。本研究結果表明，干預組T2DM大鼠經二甲雙胍治療后體質量減輕且飲食、飲水量均減少，同時FBG、FINS、HOMA-IR、TC、TG、LDL-C水平均降低而HDL-C水平升高，臨床癥狀、糖脂代謝、胰島素抵抗均得到改善；此外，干預組經二甲雙胍干預后BA也明顯下降。因此，我們推測二甲雙胍改善糖脂代謝的作用可能與影響BA代謝有關。

在肝內由膽固醇直接合成的BA稱為初級BA，初級BA進入腸道由腸道菌群催化合成次級BA[9]。肝臟產生的BA進入腸道后，95%會被腸道重吸收，這些重吸收的BA隨門靜脈再次進入肝臟，肝臟再將其與新合成的BA一起進入腸道，即“肝腸循環”。經典途徑是BA合成的主要途徑，該過程主要依靠CYP7A1來發揮作用。生理濃度的BA結合并激活FXR，FXR通過誘導小異二聚體伴侶(SHP)下調CYP7A1的表達[5]，從而負反饋抑制BA合成。本研究結果顯示，與對照組比較，模型組肝組織中FXR表達減少，與相關研究結果一致[10]。T2DM大鼠FXR表達降低的具體機制尚不清楚，可能與糖尿病大鼠BA池的改變有關。CDCA是最有效的FXR激活配體，糖尿病大鼠BA庫中CA和脫氧膽酸(DCA)增加而CDCA減少[11]，對FXR激活作用降低。MAFG作為FXR激活介導的轉錄阻遏物[6]，當糖尿病大鼠FXR表達降低時，MAFG表達也降低，同時MAFG抑制其下游基因的表達。在BA合成途徑中，CYP8B1負責CA合成[7]。研究發現，在STZ誘導的糖尿病大鼠中，CYP8B1表達升高[12]。這是由于MAFG在糖尿病大鼠中表達降低，減弱了對CYP8B1的抑制作用使得CYP8B1表達增加，致使糖尿病大鼠CA升高。與我們的實驗結果相一致，即模型組CA濃度高于對照組。

本研究結果顯示，二甲雙胍治療后干擾組大鼠FXR和MAFG表達增加而CYP8B1表達降低。這表明二甲雙胍可以通過活化腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)，使得FXR磷酸化[13]，受FXR激活的MAFG表達增加，對CYP8B1的抑制作用增強，因而CYP8B1表達降低。丙酮酸激酶(PEPCK)和葡萄糖6磷酸酶(G-6-PASE)是參與糖異生的限速酶。研究表明，FXR抑制PEPCK和G-6-PASE的活性，阻礙糖異生過程，從而改善葡萄糖耐量[14]。固醇調節元件結合蛋白(SREBP-1c)是調節膽固醇代謝和甘油三酯合成的關鍵酶。研究發現，FXR誘導SHP的表達后，與肝X受體(LXR)結合后抑制SREBP-1c的表達，進而降低膽固醇和甘油三酯合成[15]。此外，MAFG作為FXR的下游因子發揮其共調節作用，參與FXR的降低糖脂作用以調節體內糖脂平衡[5，6]。

BA合成途徑的直接產物主要是CA和CDCA，它們的相對量之間的平衡決定了BA池的總體疏水性[16]。CA和CDCA之間平衡的主要調節劑是CYP8B1，CYP8B1確定了12α-羥基化BA和非12α-羥基化BA的相對量。CA是肝組織中含量最豐富的12α-羥基化BA。Kim等[14]研究表明，人胰島素抵抗與血清12α-羥基化BA水平升高有關。Kaur等[7]發現，CA的缺乏導致CYP8B1缺陷小鼠的胰島素抵抗改善。本研究結果顯示，干預組肝組織中CA表達減少，HOMA-IR降低，胰島素抵抗明顯改善。這是由于二甲雙胍抑制CYP8B1表達后降低CA表達，促進血清12α-羥基化BA表達，從而改善了胰島素敏感性[18]；同時，CA的減少也降低了膽汁中膽汁鹽的疏水性，降低膽固醇的溶解度[19]，從而減少膽固醇的吸收。因此，我們認為二甲雙胍可以通過調節FXR-MAFG-CYP8B1信號通路來干擾BA代謝，從而改善糖脂代謝和胰島素敏感性，這對進一步探索二甲雙胍的新藥物靶點具有重要意義。