首發兒童精神分裂癥患者腦源性神經營養因子水平及神經元凋亡研究

楊 俊，佟 靚，周立國*

(1.大理州第二人民醫院，云南 大理 671000；2.云南省精神病醫院，云南 昆明 650101

兒童精神分裂癥具有起病年齡小、易反復發作、治療難度大、預后差的特點，嚴重影響患者身心健康[1]。精神分裂癥的病因學研究指出，神經發育障礙是精神分裂癥發病的重要影響因素。精神分裂癥患者存在腦室擴大、腦溝變寬、海馬體積縮小、腦體積減小等顱腦異常[2]。Sporn等[3]研究顯示，兒童精神分裂癥患者的腦灰質和腦體積較健康兒童小，且其腦灰質密度降低早于精神分裂癥的癥狀出現，精神分裂癥患者的腦發育異常在胎兒期就已出現，主要表現為腦室擴大，這種病理改變貫穿于童年期[4]。腦源性神經營養因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是神經發生蛋白，是神經可塑性的重要調節因子[5-6]，BDNF表達減少可引起內嗅皮質、額葉皮質、海馬和扣帶回細胞結構紊亂，破壞神經元的交互對話，導致顱腦發育異常[7]，BDNF對神經元的生物學作用提示其可能是精神分裂癥發病的影響因素。β Ⅲ型微管蛋白(β-Ⅲ-tubulin，Tuj-1)是一種參與神經元細胞類型特異性分化的微管蛋白，在神經元突觸分化時表達增加，參與神經元的交互對話[8]。當神經元受損、突觸分化障礙時，Tuj-1表達水平降低，Tuj-1可作為神經元突觸分化的特異性標志物[9]。在細胞凋亡進程中，胱天蛋白酶3(Caspase-3)被激活提示細胞凋亡已進入不可逆階段，有研究指出，Caspase-3作為神經元凋亡相關指標在神經元輕微損傷時表達就會增加[10]。基于精神分裂癥的顱腦病變特點及BDNF對神經元的調節作用，本研究探索BDNF、神經元標志物Tuj-1和凋亡標志物Caspase-3在兒童精神分裂癥中的變化，為揭示兒童精神分裂癥的病因和發病機制提供參考。

1 對象與方法

1.1 對象

以2015年8月-2018年3月在大理州第二人民醫院就診的兒童精神分裂癥患者為研究組。納入標準：①符合《精神障礙診斷與統計手冊(第4版)》(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，fourth edition，DSM-IV)精神分裂癥診斷標準；②年齡3～12歲；③既往未經任何治療的首發患兒，無系統精神類藥物應用史；④漢族；⑤無心、肝、腎等器質性疾病。排除標準：①合并腦炎、癲癇、多發性硬化、精神發育遲滯等神經系統器質性疾病者；②有顱腦外傷病史者。符合納入標準且不符合排除標準共35例。同期采用計算機隨機法從在大理州第二人民醫院體檢的兒童中選取30例年齡、性別、受教育程度與研究組匹配的健康兒童為對照組。納入標準：①年齡3～12歲；②漢族；③無心、肝、腎等器質性疾病。排除標準：①合并腦炎、癲癇、多發性硬化、精神發育遲滯等神經系統器質性疾病者；②有顱腦外傷病史者；③二系三代有精神病家族史或自殺史者。本研究經大理州第二人民醫院倫理委員會審核批準。研究對象均由其監護人簽署知情同意書。

1.2 BDNF、Caspase-3和Tuj-1的mRNA檢測

所有兒童于入組當日08∶00-10∶00由護士抽取空腹靜脈血5 mL置于抗凝管中作為標本。用Trizol裂解液提取總RNA后于-80℃保存，將總RNA逆轉錄為cDNA，再進一步進行cDNA擴增。

使用逆轉錄試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA。逆轉錄體系50 uL：5×PrimeScript Buffer 10 μL，Oligo(dT) primer (50 μM) 2.5 μL，Prime Script RT Enzyme MixI 2.5 μL，Random 6 mers(100 uM)2.5 μL，Total RNA 2.5 μL，RNase Free ddH2O 30 μL。RNA逆轉錄條件：① 37℃，15 min，然后進行；②85℃，5 s，最后進行；③4℃，forever。在cDNA中加入引物后進行擴增，RT-PCR反應體系20 μL：cDNA 1 μL，Primer1 0.5 μL，Primer2 0.5 μL，Mix 10 μL，RNase Free ddH2O 8 μL。RT-PCR順序反應條件：①50℃，2 min，②95℃，2 min，③95℃ 15s，60℃ 1min 該步驟進行40個循環，④95℃，15 s，⑤60℃，30 s，⑥ 95℃，15 s。每個樣本做3個重復。BDNF、Caspase-3、Tuj-1基因引物由美國英杰(Invitrogen)生物公司合成。BDNF：上游引物：5′-CAGAGGAGCCAGCCCGGTGCG-3′，下游引物：5′-CTCCTGCACCAAGCCCCATTC-3′。Caspase-3：上游引物：5'-ACCGATGTCGATGCAGCTAA-3'；下游引物：5'-GGTGCGGTAGAGTAAGCATA-3'。GAPDH：上游引物：5'-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3'；下游引物：5'-TTGGCTCCACCCTTCAAGTG-3'。Tuj-1：上游引物：5'-CCATCTAGCTACTGACACTG-3'；下游引物：5'-AAGTGGACTCACATGGAGTG-3'。本研究所有實驗均重復3次。

1.3 設備與試劑

Trizol裂解液購買于美國西格瑪(Sigma)生物公司。逆轉錄試劑盒購買于日本他卡若生物公司。PCR擴增儀購于美國伯樂公司，型號Tetrad2。RT-PCR系統購于美國應用生物系統公司，型號7300。

1.4 統計方法

2 結 果

2.1 兩組一般資料比較

研究組年齡(8.31±2.16)歲；男生18例，女生17例；小學19例，學齡前16例。對照組年齡(9.02±1.76)歲；男生15例，女生15例；小學16例，學齡前14例。

2.2 兩組BDNF mRNA、Caspase-3 mRNA和Tuj-1 mRNA表達水平比較

研究組BDNF mRNA和Tuj-1 mRNA表達水平均低于對照組，Caspase-3 mRNA表達水平高于對照組，差異均有統計學意義(P<0.05或0.01)。見表1、圖1。

表1 兩組BDNF mRNA、Caspase-3 mRNA和Tuj-1 mRNA表達比較

圖1 兩組BDNF mRNA、Caspase-3 mRNA和Tuj-1 mRNA表達比較

3 討 論

兒童精神分裂癥是較常見的兒童精神疾病，與神經發育異常關系密切。精神分裂癥與神經元的變性、凋亡密切相關，其特異性癥狀、認知缺陷的持續進展及治療效果較差可能與神經細胞的功能下降有關。兒童及青少年階段是神經細胞快速增殖、生長時期，這一時期神經細胞發生大量凋亡必將影響兒童的腦組織生長和發育，從而導致一系列神經及精神問題。

本研究顯示，兒童精神分裂癥患者Tuj-1表達較健康兒童低。Tuj-1是一種微管蛋白，是神經元的特異性抗原之一。研究顯示[11-12]，在大腦發育過程中，神經干細胞分化為神經元是一個循序漸進的過程，分別經歷了神經干細胞、神經祖細胞、神經母細胞、不成熟神經元和成熟神經元階段。在此過程中，Tuj-1的表達增加提示神經元正處于發展和成熟的過程，Tuj-1表達減低提示神經元減少[13]。本研究中患兒Tuj-1表達降低，提示精神分裂癥患兒腦內神經元減少、受損或死亡。

Caspase-3是細胞凋亡下游的關鍵執行者之一，其表達上調提示凋亡蛋白表達增加，即凋亡的細胞數量增加。本研究顯示，精神分裂癥患兒Caspase-3表達較健康兒童高，提示精神分裂癥患兒腦內凋亡的神經元數量較正常兒童多。

本研究中，研究組BDNF mRNA表達低于對照組，推測BDNF表達減少后神經元失去相應滋養，從而導致神經元凋亡，產生功能缺損，表現出精神分裂癥的一系列癥狀。神經營養因子在神經元的發生、發育、成熟及凋亡過程中均發揮重要調節作用，對中樞和外周神經元的存活起到支撐作用[14-15]。BDNF表達于大腦皮層、海馬、紋狀體等與精神分裂癥發病相關的腦區，對新神經元的發生、發育和存活具有調控作用，對發育成熟神經元的功能維持具有保護作用[16-17]，BDNF表達降低會產生一系列顱腦發育異常及神經精神障礙[18]。本研究結果顯示，精神分裂癥患兒BDNF表達減少，與既往研究結果一致。

綜上所述，兒童精神分裂癥患者BDNF mRNA和Tuj-1mRNA表達減少，Caspase-3 mRNA表達增加，推測BDNF、Tuj-1和Caspase-3可能與兒童精神分裂癥的發病相關。本研究的局限性在于：僅觀察35例首發精神分裂癥患兒的BDNF、Tuj-1及Caspase-3的mRNA表達變化，且未對mRNA轉錄的蛋白質進行研究，在今后的研究中應擴大樣本量，同時對相關轉錄因子及轉錄后蛋白進行研究，并進一步探討BDNF表達減少、神經元凋亡后神經元的功能及交互對話，以揭示兒童精神分裂癥的病因和發病機制。