2型糖尿病不同糖耐量患者血清miR-103的檢測和臨床應用

臧素綱，陳鑫，韓霜，陳曦，周玉貴

(南通大學附屬東臺醫院檢驗科，江蘇 東臺 224200)

2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM）是由復雜的遺傳因素和環境因素共同作用的一種糖代謝性疾病。胰島素分泌缺陷和胰島素抵抗是T2DM發病機制的兩個要素，不同患者其胰島素抵抗和胰島素分泌缺陷具有的重要性不同，同一患者在疾病進展過程中兩者的相對重要性也可能發生變化[1]。T2DM患者的糖耐量可存在單純空腹血糖受損或（和）單純糖耐量受損，表現為單純空腹血糖升高(IFH)，或單純糖負荷后血糖升高(IPH)，或兩者同時升高(IFH/IPH)3種不同狀態[2-4]。

microRNAs是一類非編碼蛋白質的并可參與基因轉錄后水平調控的單鏈小分子RNA。目前，已研究發現作用機制相對明確的，與調節胰島素敏感性及胰島素抵抗形成相關的miRNAs有miR-125a、miR-103/107、miR-122、miR-126、miR-181、miR-29、miR-133a 等[5-8]。 本實驗應用 poly(A)聚合酶加尾SYBR Green I實時熒光定量逆轉錄PCR法檢測血清miR-103，探討其在2型糖尿病不同糖耐量模式及正常人間的表達差異和臨床應用價值。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集2014年10月至2015年2月南通大學附屬東臺醫院測定空腹血糖和餐后2h血糖的糖尿病患者標本，收集同期南通大學附屬東臺醫院體檢中心的健康體檢者作為正常對照組。本研究經南通大學附屬東臺醫院倫理委員會批準，且所有實驗對象均知情同意。實驗分組如下：

a．健康對照組（N組）該組均系本院健康體檢者，無糖尿病高危因素，無典型的2型糖尿病癥狀，空腹血糖＜6.1mmol/L，血總膽固醇＜5.17mmol/L，血甘油三酯＜1.70mmol/L，BMI指數＜24，無重大疾病既往史，其他實驗室及影像學檢查無異常發現。

b．空腹血糖升高組(i-IFG組)該組符合2型糖尿病診斷標準，空腹血糖FPG≥7.0mmol/L，且OGTT 2hPG＜11.1mmol/L，本組 FPG測定值為7.73±0.80mmol/L，2hPG 測定值為 9.25±1.24mmol/L，HbA1c%測定值為 6.8±1.0。

c.餐后血糖升高組(i-IGT組)該組符合2型糖尿病診斷標準，OGTT 2hPG≥11.1mmol/L，同時空腹血糖FPG＜7.0mmol/L，本組FPG測定值為6.42±0.59mmol/L，2hPG 測定值為 9.25±1.24mmol/L，HbA1c%測定值為 6.6±1.2。

d．空腹血糖及餐后血糖升高組 (IFG&IGT組)該組符合2型糖尿病診斷標準，空腹血糖FPG≥7.0mmol/L，且 OGTT 2hPG≥11.1mmol/L，本組 FPG測定值為9.23±2.51mmol/L，2hPG測定值為16.12±4.10mmol/L，HbA1c%測定值為 8.9±1.7。

1.2 儀器與試劑 日立7600全自動生化分析儀為日本日立公司生產，華臣MQ2000PT糖化血紅蛋白儀，Rotor-Gene Q實時熒光定量PCR分析儀生產廠家是德國凱杰 （QIAGEN）公司，miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control，miRNeasy Serum/Plasma Kit，miScript II RT Kit miScript SYBR Green PCR Kit和miScript Primer Assay皆為德國凱杰公司生產。擴增miR-103的引物是hsa-miR-103a-3p，其序列為 AGC AGC AUU GUA CAG GGC UAU GA，也為德國凱杰公司提供。

1.3 方法

1.3.1 總RNA的提取 ⑴變性裂解；⑵氯仿的抽提；⑶沉淀總RNA；⑷RNA酶變性處理；⑸沉淀總RNA；⑹清洗干燥硅膠膜；⑺洗提RNA。

1.3.2 RNA純度檢測

1.3.3 逆轉錄反應獲得cDNA ⑴將15μl逆轉錄反應混合物分裝到各PCR反應管中，再加入5μl模板RNA；⑵在PCR儀上設置逆轉錄條件37℃下孵育 60min，95℃下孵育 5min。

1.3.4 以cDNA為模板進行PCR擴增反應 ⑴將18μl PCR反應混合物加入各個PCR反應管中，再加入2μl模板cDNA；⑵設置PCR反應程序如下：預變性15min后按變性15sec、退火30sec及延伸30sec三個步驟設置40個循環；⑶開始PCR擴增反應。

1.3.5 標準曲線的制作 本課題采用C.elegansmiR-39的miRNA模擬物制作標準曲線，為絕對定量法。將標準品與待測樣本同時進行擴增，擴增后根據標準品的濃度對應的CT值繪制標準曲線，根據標準曲線及待測樣本的CT值計算出該樣本的絕對含量。

1.4 統計學方法 數據分析采用SPSS 19.0軟件進行，將Ct值轉換成拷貝數，經方差齊性分析，拷貝數不滿足正態分布和方差齊性條件，故用Mann-Whitney U檢驗進行組間比較。根據血清miR-103的表達量，繪制ROC曲線，評價兩種miRNAs的診斷效能。以P＜0.05為差異有統計學意義。計數資料以（±s）表示。

2 結果

2.1 總RNA抽提純度檢測的結果 經過SMA1000微量紫外分光光度計測量，本研究所有標本抽提RNA 溶液的A260/A280比值（1.906±0.089）在1.8-

2.1 范圍內，表明RNA的純度較好，可以用于后續的實驗。

2.2 實時定量逆轉錄PCR擴增曲線及標準曲線poly(A)聚合酶加尾法SYBR Green I實時定量逆轉錄PCR法檢測血清miR-103，擴增曲線呈S型，標準曲線呈線性，見圖1。

圖1 miR-103擴增曲線及標準曲線

2.3 PCR擴增產物的熔解曲線 miR-103熔解曲線在（77.5±0.2）℃呈現單峰，無引物二聚體及其它非特異雜峰存在，表明PCR反應參數合適，擴增產物特異性好，見圖2。

圖2 miR-103擴增產物的熔解曲線

2.4 血清中miR-103在四組人群標本中的檢測結果 i-IFG組血清miR-103的表達水平均高于i-IGT組的表達水平 （P=0.001），i-IFG組血清miR-103的表達水平均高于IFG&IGT組的表達水平（P=0.001），i-IGT組血清 miR-103的表達水平均高于IFG&IGT組的表達水平（P=0.036），三個病例組血清miR-103表達水平和N組血清miR-103表達水平比較差異有統計學意義 （P=0.015、P=0.046、P=0.001），見表 1。

2.5 miR-103在不同糖耐量模式的診斷效能 在IFG組，血清miR-103在ROC曲線下面積（AUC值）為0.733，診斷敏感性為80.0%，特異性為76.5%，；在IGT組，血清 miR-103在 ROC曲線下面積（AUC值）為0.626，診斷敏感性為64.7%，特異性為70.4；在IFG&IGT組，血清miR-103在ROC曲線下面積（AUC值）為0.768，診斷敏感性為88.2%，特異性為62.5%，見圖3。

表1 四組人群血清中miR-103表達水平的比較結果

圖3 miR-103診斷不同糖耐量模式的ROC曲線圖

3 討論

2型糖尿病患者的糖耐量可存在單純空腹血糖受損單純糖耐量受損，表現為3種不同空腹和餐后高血糖模式。i-IFG主要是由于肝臟胰島素敏感性下降、肝臟糖生成的增加、早期胰島素分泌不足和胰高血糖素分泌增加；i-IGT主要是由于外周胰島素抵抗，進展性的胰島β細胞功能喪失以及葡萄糖依賴的促胰島素多肽分泌的減少和胰高血糖素的增加[2-4，9，10]。 目前主要是通過測定 FPG 和進行OGTT試驗和糖化血紅蛋白等檢驗、檢測項目對不同糖耐量水平進行鑒別診斷，但是這些檢測項目都不同程度存在對患者進行多次采血和多次檢測的繁瑣，并且存在患者檢驗前的準備、采血時間等質量控制難以標準化的缺點。因此學術界探尋診斷2型糖尿病不同糖耐量水平相關的新型生物學檢測標志物一直是個熱點。

Trajkovski等[11]進行動物實驗時發現miR-103可以調節胰島素的敏感性，沉默miR-103可以改善糖穩態和胰島素敏感性，miR-103被抑制后可以使miR-103靶基因Caveolin-1上調，繼而提高胰島素信號，降低脂肪組織的大小，增加胰島素刺激的糖攝取。

本實驗中miR-103在三個病例組與對照組比較差異有統計學意義 （P=0.015 0.046 0.001，P＜0.05），三個病例組間的比較差異有統計學意義（P=0.001 0.001 0.036，P＜0.05）。i-IFG 組的表達量高于N組，i-IGT組和IFG&IGT組低于N組，且三個病例組miR-103的表達量依次下降，出現這樣的結果可能是因為i-IFG組是空腹血糖異常，主要與胰島素靶器官肝臟調節血糖的功能有關，出現了胰島素敏感性下降和抵抗，而i-IGT組和IFG&IGT組都存在糖負荷后糖代謝異常，miR-103主要是通過胰島素外周靶器官脂肪組織和肌肉進行調節糖負荷后的血糖水平，可能是調節的方式不一樣，與血糖代謝的負反饋有一定的關聯，也可能確定病例組時沒有考慮到未知的影響因素 （如病例的數量、病人的用藥情況及并發癥等因素），具體機制有待今后實驗進一步的探討。ROC曲線下面積值在0.50～0.70時有較低準確性，在0.70～0.90時有一定的準確性，在0.90以上時有較高準確性。本文i-IFG組血清miR-103在 ROC曲線下面積（AUC值）為0.733，IFG&IGT組血清miR-103在ROC曲線下面積分別為0.768，靈敏度比較高，提示miR-103在2型糖尿病診斷和不同糖耐量水平模式的鑒別診斷有一定的臨床價值，可以作為2型糖尿病治療用藥方案選擇的生物學標志物，糖化血紅蛋白可以反映過去6～8周的平均血糖水平，是監視血糖水平可靠的指標[12]，但是它既受空腹血糖和餐后血糖水平共同影響，也與高血糖狀態的持續時間有關系，在2型糖尿病不同糖耐量水平的診斷和鑒別診斷的價值并不高，本實驗miR-103在這一層面上是有一定的優勢，可以與糖化血紅蛋白的進行聯合檢測，提高臨床應用價值。4結論

血清miR-103在2型糖尿病不同糖耐量水平各分組中的表達情況是i-IFG組＞N組＞i-IGT組＞IFG&IGT組，miR-103在病例組與對照組的表達水平差異有統計學意義，且各病例組間miR-103的表達水平的差異亦有統計學意義。血清miR-103可作為2型糖尿病不同糖耐量水平的新型生物學標志物，對2型糖尿病和2型糖尿病不同糖耐量水平的診斷、鑒別及治療方案的選擇具有一定的臨床應用價值。