子宮托細胞毒性試驗兩種方法的比較

刁立琴 康莉 付釗 高保栓 韓婷 河北省醫療器械與藥品包裝材料檢驗研究院 （河北石家莊 050061）

內容提要：目的：比較兩種細胞毒性試驗方法對子宮托細胞毒性評價的差異。方法：GB/T14233.2-2005的MTT法和GB/T 16886.5-2017的MTT法。結果：RGR分別為13%和75%。結論：細胞毒性試驗方法的選擇應根據樣品的理化性質，模擬臨床的實際使用情況進行選擇。

子宮托是一種Ⅱ類醫療器械，其材質主要為聚乙烯和硅橡膠類。經臨床觀察，使用子宮托治療盆腔器官脫垂，可以明顯緩解患者脫垂和排尿相關癥狀，改善患者的生活質量。因其損傷小，操作簡單，安全有效，在盆腔器官脫垂治療中被廣泛應用，近些年又被拓展到壓力性尿失禁、宮頸功能不全和盆底功能障礙等相關疾病的治療中[1]。隨著我國人口老齡化的加速，盆底功能障礙患者逐漸增加，子宮托的應用將更為廣泛，正確評價其安全性尤為重要。

體外細胞毒性試驗具有簡便、快速、敏感性高的特點，是醫療器械生物學評價體系中常用的檢測指標之一，是一種離體狀態下模擬生物生長環境，檢測醫療器械產品接觸人體組織后生物學反應的體外試驗。本文分別用GB/T14233.2-2005和GB/T 16886.5-2017中的MTT試驗方法對子宮托的細胞毒性進行測定比較。

1.材料與方法

1.1 一般材料

試驗樣品：子宮托（來自生產企業送樣，材質為硅橡膠類）。

細胞：小鼠成纖維細胞L-929（中國科學院上海生命科學院細胞資源中心）。

主要試劑：1640培養基（北京索萊寶生物科技有限公司），MEM培養基（賽默飛世爾（蘇州）儀器有限公司），胎牛血清（Biological Industries Israel Beit Haemek Ltd，DMSO（SIGMA-ALDRICH），異丙醇（天津市百世化工有限公司），ZDBC的聚氨脂膜（Hatano Research Institute，FDSC）。

1.2 方法

1.2.1 GB/T14233.2-2005中MTT試驗方法

試驗液的制備。①樣品浸提液：取樣品，剪成約1cm×3cm小條，按0.2g/mL的比例，加入含10%血清的1640培養基，37?C浸提24h備用；②空白對照液：同批含10%血清的1640培養基，同法制備；③陰性對照液：高密度聚乙烯按0.2g/mL的比例，加入含10%血清的1640培養基，同法制備；④陽性對照：5g/L的苯酚溶液，同法制備。

試驗方法。按照GB/T14233.2-2005規定的MTT試驗方法進行[2]。將1×104/mL細胞懸液接種于96孔板，每孔100μL，置5%CO2培養箱中37?C培養24h后，棄去原培養液。分別加入樣品浸提液、空白對照液、陰性對照液和陽性對照液，每孔100μL，置CO2培養箱中37?C培養72h，然后每孔加入5g/L的MTT溶液20μL，繼續培養4h后棄去孔內溶液，加入DMSO 150μL，振蕩10min，在酶標儀570nm和630nm雙波長下測定吸光度（OD值）。按公式（1）計算細胞相對增殖率（RGR）：

表1. MTT法細胞毒性反應分級(%)

注：RGR——相對增殖率，%；A——供試品組（陰性組、陽性組）吸光度；A0——空白對照組吸光度。（MTT濃度為5g/L，溶于PBS溶液。）

結果判定。根據RGR按表1分級標準判定。陰性對照組的反應不大于1級，陽性對照組的反應至少為3級時，判定結果可靠。

1.2.2 GB/T 16886.5-2017中MTT試驗方法

試驗液的制備。①樣品浸提液：取樣品，剪成約1cm×3cm小條，按0.2g/mL的比例加入含10%胎牛血清的MEM培養液，37?C浸提24h備用；②空白對照液：同批10%胎牛血清的MEM培養液，同法制備；③陰性對照液：取高密度聚乙烯膜按表面積3cm2/mL的比例加入含10%胎牛血清的MEM培養液，同法制備；④陽性對照液：取含ZDBC的聚氨脂膜按表面積3cm2/mL的比例加入含10%胎牛血清的MEM培養液，同法制備。

試驗方法。按照GB/T 16886.5-2017規定的MTT試驗方法進行[3]。將1×105/mL細胞懸液接種于96孔板，每孔100μL。置5%CO2培養箱中37?C培養24h后，棄去原培養液。加入樣品浸提液、空白對照液、陰性對照液和陽性對照液，每孔100μL置CO2培養箱中37?C培養24h。除去原培養液，每孔加入1g/L的MTT溶液50μL，繼續培養2h后除去孔內MTT溶液，加入100μL異丙醇，振蕩10min，在酶標儀570nm和650nm雙波長下測定吸光度（OD值）。按公式（2）計算存活率：

注：OD570e——試驗樣品組（陰性、陽性對照組）光密度平均值；OD570b——空白對照組光密度平均值。（MTT濃度為1g/L，新鮮溶于不含酚紅的MEM溶液。）

結果判定。當細胞存活率下降到＜空白的70%，則具有潛在的細胞毒性。

2.結果

GB/T14233.2-2005MTT法的RGR為13%（見表2），GB/T16886.5-2017MTT法的RGR為75%（見表3），兩者差異明顯。

3.討論

同種樣品的細胞毒性試驗用GB/T 16886.5-2017MTT方法得出的RGR結果明顯高于GB/T14233.2-2005MTT方法的RGR結果。分析原因如下。

GB/T14233.2-2005的細胞接種密度為1×104/mL，而GB/T 16886.5-2017的細胞接種密度為1×105/mL，兩者相差10倍。同時鏡下觀察，細胞形態均正常，生長良好。前者細胞密度稍顯稀疏，后者稍顯致密，考慮接種密度為1×104/mL時，L929細胞在24h仍處于緩慢增殖狀態，會擴大細胞對待檢物的反應；而接種密度為1×105/mL時，細胞在24h后便進入了對數生長期，細胞狀態較為穩定。同時也有相關文獻試驗證明，細胞種板數目增大，細胞增殖率逐漸增高，這和本試驗得出的測試結果一致[4]。

GB/T14233.2-2005在浸提液中培養時間為72h，而GB/T 16886.5-2017在浸提液中培養時間為24h。隨著培養時間的延長，由于浸提液中硅橡膠聚合物的降解片段會進一步降解，在較小體積中逐漸累積，對細胞毒性的影響較為持續而顯著。

表2. GB/T14233.2-2005MTT法試驗結果

表3. GB/T16886.5-2017MTT法試驗結果

不同的浸提介質在浸提樣品時，在溶液條件下發生相互作用，因浸提液的成分不同可能也會導致結果差異。

GB/T14233.2-2005方法中在加入MTT前沒有去除浸提液，而GB/T 16886.5-2017方法中則全部去除浸提液后再加入MTT，考慮在浸提液環境下，樣品浸提析出的成分有可能和MTT反應，而影響結果出現差異。

總之，目前GB/T 16886.5-2017中的MTT法和GB/T14233.2-2005的MTT法作為國家標準，被多數企業直接引用到評價申報醫療器械生物安全性，但是并不代表該試驗方法適合所有醫療器械。同時，體外細胞毒性試驗條件和臨床實際使用的環境條件存在差別，尤其某些降解、溶出的材料應謹慎對待[5]。當前醫療器械產品種類繁多，發展迅速，如何客觀的評價醫療器械的細胞毒性，方法的選擇尤為重要，需要全面了解產品的理化性質，盡量模擬樣品實際使用情況或嚴于樣品實際使用條件進行試驗。建議根據產品材料的不同，選擇適宜的細胞毒性試驗方法。