一種低濃度胰蛋白酶獲得胰島單細(xì)胞的方法

雷維瓊，劉欣煜，艾慧婷，林顯光

(1.中南民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，醫(yī)學(xué)信息分析及腫瘤診療湖北省重點實驗室,湖北 武漢 430074;2.武漢第四中學(xué),湖北 武漢 430034)

1 引言

Ⅰ型糖尿病是絕對胰島素分泌不足導(dǎo)致的持續(xù)性高血糖癥狀[1]。治療Ⅰ型糖尿病一直都是一個非常具有挑戰(zhàn)性的問題，但無論如何，研究的實驗基礎(chǔ)是要能分離出數(shù)量足、形態(tài)好的胰島細(xì)胞[2]。同時，胰島單細(xì)胞的分離培養(yǎng)對于通過膜片鉗手段揭示糖尿病的發(fā)病機制與研究治病藥物的功能機制十分重要。因此，本文對急性分離培養(yǎng)大鼠胰島單細(xì)胞方法進(jìn)行改良，為后期實驗需要胰島單細(xì)胞的研究提供一種新的獲取途徑。

2 材料與方法

2.1 實驗動物

雄性SD大鼠，SPF級，體重180 ～ 250 g，購買于湖北省疾病預(yù)防控制中心。飼養(yǎng)于12 h光照/12 h黑暗的環(huán)境中，自由攝食飲水。動物實驗與處理均遵照《中南民族大學(xué)實驗動物使用與福利指導(dǎo)手冊》[3]。

2.2 實驗材料

RPMI-1640培養(yǎng)液和FBS(Fetal bovine serum)購買于Gibco，膠原酶V購買于Sigma Aldrich，其余試劑均購買于Biosharp或國藥化學(xué)試劑。

2.3 實驗方法

2.3.1 溶液配制

無鈣無鎂KRBB溶液(g/L)：7.54 NaCl， 0.35 KCl， 0.16 KH2PO4，0.42 NaHCO3，2.38 Hepes，1 BSA；pH值7.0。10 mg/mL膠原酶V溶液：將0.2 g的膠原酶V溶于20 mL的無鈣無鎂的KRBB溶液中，過濾，1 mL分裝，凍于-20 ℃保存。

2.3.2 胰島的分離提取

實驗前將大鼠斷糧12～16 h，飲水不限。將10 mg/mL膠原酶V溶液稀釋為2 mg/mL膠原酶V溶液置于冰上預(yù)冷。用10%的水合氯醛以0.3 g/kg的劑量腹腔注射來麻醉大鼠，將大鼠腹側(cè)暴露，用膠帶固定于木板。給腹部消毒后，按圖1(A)所示從大鼠生殖器上方剪開皮膚，然后再沿黑線的方向剪開暴露出大鼠的腹腔。用顯微剪和顯微鑷小心剝離總膽管后用止血鉗將圖1(B)中指示的胰管與十二指腸交匯處(白點)鉗住，同時用另一止血鉗將總膽管走向肝臟的分支鉗住。從圖1(B)所示的總膽管處緩慢灌入冷的2 mg/mL 膠原酶V溶液進(jìn)入胰腺。待看到如圖1(C)與圖1(D)所示，即胰頭胰尾膨脹后剪下胰腺，將其沖洗干凈，放入留有1 mL的 2 mg/mL 膠原酶V溶液的離心管中置于37 ℃消化，每隔3～5 min吹打一次，使胰腺均勻消化，直至組織成細(xì)沙狀，約10 min，立即終止消化，再根據(jù)胰島的折射率的不同手動挑出胰島。

圖1 大鼠解剖過程

2.3.3 胰島單細(xì)胞的分離

取出1 mL 0.015% 用無鈣無鎂KRBB配制的胰蛋白酶,加2 mL無鈣無鎂KRBB溶液混勻，即0.005%的胰蛋白酶溶液。將提好的胰島用無鈣無鎂KRBB輕輕吹打、清洗后離心，去上清。加入5 mL 3mM的EGTA孵育9 min，期間吹打一次，孵育完成后離心去上清。在離心管中加入3 mL 0.005%的胰蛋白酶溶液置于37 ℃搖床，170 r/min，每5 min吹打約30～40 s，消化時間約為8-15 min。在消化的過程中應(yīng)當(dāng)每隔3～5 min吹打幾次，同時還要取1、2滴消化液在20倍顯微鏡下觀察消化的狀況，直至大部分胰島呈單細(xì)胞的狀態(tài)，并且光滑圓潤飽滿。消化完成后加入10 mL培養(yǎng)基混勻終止消化，500 r/min, 離心5 min，去上清。加入適量培養(yǎng)基，吹打均勻,滴加在已用L-型多聚賴氨酸處理過的玻片上，每片滴加40 μL細(xì)胞重懸液，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中90～120 min貼壁，再在每個孔中輕輕加入1 mL 含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基。

2.3.4 電生理實驗

記錄動作電位的外液成分[4]是(mmol/L)：140 NaCl，10 Hepes，1 MgCl2，2.5 CaCl2，3.6 KCl，pH值7.35。電極電阻一般為3～5 MΩ。電極內(nèi)液成分[4]是(mmol/L)：76 K2SO4，5 NaCl，10 KCl，1 MgCl2，10 Hepes，pH 7.35。11.1 mM葡萄糖加在外液中來記錄膜電位[4]。膜片鉗實驗是用EPC-10放大器和PatchMaster軟件(HEKA，德國)進(jìn)行。所有的電生理實驗都是在25-33 ℃并且標(biāo)準(zhǔn)全細(xì)胞模式下進(jìn)行的。動作電位是將細(xì)胞封接破膜后換成“電流鉗”模式，把鉗制電流調(diào)成0 pA，給一個4000 ms，500 pA的刺激即可記錄。由于胰島中70%都是β細(xì)胞，所以挑選那些較大的細(xì)胞，那些看著更像是β細(xì)胞[5]。

3 結(jié)果與分析

3.1 在體視顯微鏡下觀察分離的胰島

胰島形態(tài)的完好對于分離單細(xì)胞來說十分重要。為了讓后續(xù)試驗順利進(jìn)行，事先在體視解剖鏡下觀察消化完成的胰島。在一束斜照的光源下，由于胰島組織的折光性較好，會比其他腺泡組織亮，在挑取胰島時，發(fā)現(xiàn)胰島就像沙漠里的珍珠，十分白亮，如圖2所示。圖2(a)中紅色圈中的即是胰島組織，其余的沙沙狀的則為腺泡組織，圖2(b)則為分離純化完全的在體視解剖鏡下觀察的胰島組織。一般能分離出200～300個胰島組織。

3.2 胰島β細(xì)胞的動作電位記錄

如圖3所示，記錄到的胰島β細(xì)胞的動作電位是標(biāo)準(zhǔn)的動作電位的形狀。這也說明本文提取的胰島單細(xì)胞是有興奮性的，具有良好活性的。

4 結(jié)語

胰腺是由內(nèi)、外分泌腺組成的混合分泌腺，由于整個胰腺中僅有1%～2%的體積為胰島組織，因而胰島的分離純化較為困難。本研究采用的內(nèi)外聯(lián)合消化法，

圖2 體視解剖鏡下觀察的胰島組織

圖3 胰島β細(xì)胞的動作電位

將膽總管的分支截住，逆行灌注膠原酶V，快速剪下胰腺，放入酶中消化。分離形狀好的胰島對于分離單細(xì)胞來說十分重要。將胰島分離成單細(xì)胞的方法是采用Dispase-Ⅱ和DNAase聯(lián)合消化或者是0.015%的胰蛋白酶直接消化，但DNase和Dispase這兩種酶相較于胰蛋白酶來說價格較高，本研究是將0.015%的胰蛋白酶稀釋了3倍即0.005%的胰蛋白酶來分離單細(xì)胞，消化時間較短，8～15 min。從電生理的結(jié)果表明這樣低濃度的胰蛋白酶消化分離的單細(xì)胞的活性不錯，興奮性良好。這樣來看本研究的分離胰島單細(xì)胞的方法分離出的單細(xì)胞也具有良好活性，適用于膜片鉗電生理實驗，同時節(jié)省了實驗耗材與費用。