植物提取物主要抑菌活性成分分析及應用

戴詩云,毛哲浩,胡益祥,李凡榮,孫 瑞,高 治, 王 亮

(徐州醫科大學，江蘇 徐州 221004)

1 引言

我國幅員遼闊，地理環境復雜，這種獨一無二的自然生態環境培育了大量的特有植物資源，為植物提取物活性成分的抑菌作用的研究提供了得天獨厚的有力條件。如何利用這些植物資源的活性成分，研制出相關的抑菌藥物成了現代生物科學重要的研究方向。本文主要是研究生活中常見的植物提取相關的活性成分對大腸桿菌等菌種的抑菌效果。

龍眼是無患子科龍眼屬植物，目前在我國一些處于亞熱帶季風氣候的地區有大面積的種植。現如今的龍眼果實加工大多為以龍眼干、果肉罐頭為主，龍眼核在加工的過程中利用率不高，而研究龍眼核的醫用價值、生產價值可以達到廢物利用的效果，并且龍眼核作為生產的副產品，可以提高果農的收入。本文對龍眼核抑菌活性能力的研究也得出其具有相當大的潛力。石榴果皮中含有多種生物堿，抑菌實驗證實，石榴果皮的醇提取物具有廣泛抗菌作用，對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、霍亂弧菌、瘧疾桿菌等有明顯的抑制作用，此外，石榴果皮的水浸劑在適宜的環境下對各種皮膚真菌也具有不同程度的抑制作用，所以在中醫中石榴皮是治療痢疾、泄瀉、便血及遺精、脫肛等病癥的良品；現代藥理研究表明石榴果皮中富含蛋白質、氨基酸、糖及其酚類、有機酸、黃酮類、生物堿等化學成分，具有殺菌、降血糖、抗癌、免疫功能調節，增強心血管系統功能等作用，為今后石榴果皮的開發和應用提供理論依據。核桃葉又稱胡桃葉，核桃葉中富含維生素C、B、D、E，胡蘿卜素、胰島素多糖、有機酸、無機鹽等。對患有維生素缺乏癥、甲狀腺腫大、黃膽病、婦科病皮膚病等均有顯著功效。

2 材料與方法

2.1 供試菌種

大腸桿菌、沙門氏菌、革蘭氏陽性枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌

2.2 供試植物材料

取市場上購得的新鮮龍眼去殼和肉后得到龍眼核，龍眼核50 ℃烘干至恒重備用；提前儲備的石榴果皮，洗凈，去除萼筒，手工取皮，室內陰干，粉碎后過40目篩4 ℃度冷藏備用；采購所得核桃葉，精心保存。

2.3 植物提取物制備所需材料

牛津杯(杯內徑6 mm，外徑8 mm)氨芐西林和頭孢挫林藥敏濾紙片。

ZPS-250智能生化培養箱、ES-315 TOMY高壓蒸汽滅菌鍋、T-203電子天平、BCN-1360B生物潔凈工作臺、FW100型高速萬能粉碎機、PK121R冷凍離心機、THZ-82A水浴恒溫振蕩器、LXJ-Ⅱ旋轉蒸發儀。

2.4 植物提取物母液的制備

龍眼核提取物制備[1]：將提前準備好的龍眼核用粉碎機粉碎成粉末，然后用T-203電子天平稱取粉末100 g置于燒杯中，接著加入500 mL的乙醇并置于50 ℃恒溫磁力攪拌器中攪拌浸提4h，4h后將浸泡后的溶液放入離心機。首先，打開臺式的高速離心機，使離心機進入待機狀態。要注意的是在離心時，離心管內所盛溶液不能超過離心管總容量的2/3，如若超出，易容易溢出。使用前后，都應注意轉頭內是否保持干燥狀態。轉換轉頭時應注意使離心機轉軸和轉頭的卡口卡牢。離心管平衡誤差應在0.1 g以內。選擇離心參數：①按溫度設置按鈕，設定離心溫度；②按速度設置按鈕，可在RPM/RCF設置檔之間切換，用數字鍵設置離心速度，回車確定；③按轉頭設置按鈕，再用數字鍵設置轉頭型號，回車確定；④按時間設置按鈕，再用數字鍵設置離心時間，回車確定；⑤離心機剎車或加速速度一般設置在0～4之間，不宜經常調整。將平衡好的離心管對稱放入轉頭內。蓋好轉頭蓋子擰緊螺絲。按下離心機蓋門，如蓋門未蓋牢，離心機將不能啟動。按START鍵，開始離心。離心開始時，確保離心速度達到規定速度后方可進行下一步實驗。如若出現因為試管放的不平衡導致離心機明顯震動，應立即停止離心的操作，如有必要，應該直接關閉離心機并找出失誤的原因。經離心得到上清液，連續浸提2次，合并上清液，在55 ℃溫度下減壓濃縮后定容至濃度為1 g/mL。

石榴果皮溶劑提取[4]：用T-203電子天平稱取石榴果皮40 g，用5倍于樣品的乙醇溶劑作為萃取溶劑，并且在30 ℃下浸提48h，用濾紙過濾，混勻后放入離心機離心，蒸發濃縮得到不同浸膏，再用25%乙醇溶解，定容至濃度為1 g/mL。

核桃葉提取物制備[5]：取事先準備好的核桃葉干粉，以70%乙醇為提取溶劑，回流提取3次(5 h-3 h-2 h)，合并三次提取的溶液，抽濾后蒸發掉上清液至膏狀，定容10 mL備用。

2.5 菌懸液的制備

提前將實驗所需菌種用合適的培養基進行活化，量取10 mL無菌水于試管中，然后使用接種環磨擦培養基表面，取出接種環，最后將接種環放入無菌水中，充分振蕩搖勻得到菌懸液。

2.6 植物提取物抑菌活性的測定

龍眼核提取物對供試菌種的抑菌活性的測定：對病原菌絲生長的抑制作用采用生長速率法[2]。無菌條件下，用孔徑為0.8 cm的打孔器取菌落邊緣生長旺盛的菌種移入含有提取物0.01 g/mL的PDA 培養平板上 ( 極性小的粗提物先溶解在少量丙酮再與40-50 ℃瓊脂培養基混合,以利均勻分散),于培養基內加等量無菌水為對照,每處理重復3次,26 ℃恒溫培養,待對照菌落接近培養皿邊緣時,測定菌落直徑。

石榴果皮提取物對供試菌種的抑菌活性的測定：該步驟采用濾紙片法(k-b法)[6]。將采用高壓滅菌法后的培養基冷卻至45～50 ℃，在無菌環境下，將滅菌過后的培養基分別倒入培養皿中，每個培養皿1 mL，接著在每皿中加入準備好的菌懸液1 mL，用刮鏟涂抹均勻，然后取用5%的鞣化柞蠶絲素粉混懸液浸泡3 h，干熱滅菌后用無菌鑷子夾取6 mm的圓濾紙片，分別浸漬提取液60s后取出，濾干提取液后貼于瓊脂平板上，每皿放置三片，每個紙片間的距離等距，重復3次，將細菌置于28 ℃恒溫箱24 h，最后使用十字交叉法測量抑菌圈直徑，取其平均值作為實驗結果。

楊桃葉提取物對供試菌種的抑菌活性的測定：將經過活化的試驗用菌接種到營養肉湯培養基中，細菌經37 ℃培養24 h，使菌液濃度達到10.8 cfu/mL備用。在無菌條件下吸取適量的菌懸液加入到備用的平板培養基上，涂布均勻。灼熱玻璃棒在直徑為9 cm的培養皿培養基上燙出8 mm直徑孔，每孔加入25 μL提取液，做3次重復，以水做空白對照。37 ℃條件下培養24 h，采用十字交叉法測量抑菌圈直徑。取其平均值作為實驗結果。

3 實驗結果與分析

實驗結果見表1～3。

表1 不同供試植物的乙醇提取物的抑菌效果比較

注：-為抑菌圈直徑為0，即無抑菌活性

表3 不同供試植物乙醇提取物濃度為25 mg/mL時的抑菌活性比較

由表1的抑菌結果可以看出：①核桃葉的乙醇提取物對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌都具有較強的抑菌能力，對沙門氏菌的沒有很強的抑菌作用。②龍眼核與核桃葉的乙醇提取物對這4種細菌的抑制作用順序一致，即：金黃色葡萄球菌>枯草芽孢桿菌>大腸桿菌>沙門氏菌。③石榴果皮的乙醇提取物對這4種細菌的抑菌能力相差不大。

由表2、3的結果可以看出：①在乙醇濃度很高時，龍眼核對指示菌沒有抑菌作用。②隨著提取物濃度的增加，石榴果皮、核桃葉對4種細菌的抑菌作用都有增強。③隨著3種植物提取物的濃度的改變，3種植物提取物仍然是對金黃色葡萄球菌的抑菌作用最強。

由表1、2、3的結果可以分析：隨著3種植物提取物濃度的變化，它們對4種細菌的抑制效果也有著不同的變化。因此，可以猜測它們抑菌能力變化的原因是不同濃度的提取物中含有的抑菌活性成分量不同，并且含有抑菌活性成分越多，對對應細菌的抑菌效果越顯著。

4 小結與討論

龍眼核對大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌都具有明顯的抑菌效果，但是對金黃色葡萄球菌的抑菌能力更為突出。在以后的實驗研究中可以著重對龍眼核提取物抑制金黃色葡萄球菌做進一步研究。石榴果皮對大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌直徑大致相當，可見石榴果皮的活性成分的對所選的菌種的抑菌能力大致相當，在以后的實驗研究上可以把突破點放在對石榴果皮提取物的活性成分能否對大部分細菌都普遍具有抑菌效果做進一步的研究。

實驗結果表明核桃葉、石榴果皮、龍眼核都具有良好的體外抑菌能力，但目前對這三者都處于實驗研究狀態。未來龍眼核的實際應用應該在于對龍眼核保健食品的加工，應用于天然色素和食品著色添加劑，以及龍眼核提取液的純化、精制和實際應用等。龍眼核的充分利用，對于提高龍眼的實用價值，提高農民種植龍眼的經濟效益，有著深遠的實際意義，有利于進一步拓寬農民增收渠道，產生一定的社會效益。

石榴果皮中含有豐富的藥理活性成分，對人體的內分泌系統、消化道系統、生殖系統、心血管系統的疾病和抗菌、抗病毒等方面均有顯著的療效，但目前其藥理價值還不能充分的應用于臨床方面，未來可以加強石榴果皮提取的活性成分與臨床應用方面的研究，在確保臨床用藥安全的前提下，為新藥的開發打下堅實的理論基礎。石榴果皮具有廣闊的開發前景。

現代藥理研究表明，核桃葉提取物與改善記憶和抗腫瘤等作用有很大的關系，為了更全面的了解核桃葉提取物的多方面活性，本文只研究核桃葉提取物活性成分對大腸桿菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌與金黃色葡萄球菌的抑菌能力，為核桃葉在未來的植物抑菌方面開發與應用提供一些理論基礎。