分光光度法測定地表水葉綠素a的測量不確定度分析

孔凡亭，王 坤，趙芳輝

(山東嘉譽測試科技有限公司，山東 淄博 255086)

1 引言

測量不確定度是與測量結果相關聯的參數，它表征了可以合理地賦予被測量的量值分散程度[1]。葉綠素是植物光合作用中的重要光和色素，是藻類重要的組成成分之一，其濃度與水環境質量有直接關系[2,3]。在地表水環境檢測中，正確評估葉綠素a的測量不確定度具有重要意義[4]。本文用分光光度法對地表水中葉綠素a檢測過程中引起的不確定度的各個分量來源進行了分析，并對其不確定度進行了合理的評定。

2 檢測方法

2.1 方法依據

依據HJ897-2017 《水質 葉綠素a的測定 分光光度法》，對水中葉綠素a的測量不確定度進行評定。

2.2 方法原理

將一定量樣品用濾膜過濾截留藻類，研磨破碎藻類細胞。用丙酮溶液提取葉綠素，離心分離后分別于750 nm、664 nm、647 nm、630 nm波長處測定提取液吸光度，根據公式計算水中葉綠素a的濃度。

2.3 操作步驟

按照GB/T14581、HJ/T91和HJ494中的相關規定進行樣品的采集。樣品的采集一般使用有機玻璃采水器或其他適當的采樣器采集水面下0.5 m樣品，湖泊、水庫根據需要可進行分層采樣或混合采樣，采樣體積為1 L或500 mL。如果樣品中含沉降性固體(如泥沙等)，應將樣品搖勻后倒入2 L量筒，避光靜置30 min,取水面下5 cm樣品，轉移至采樣瓶。在每升樣品中加入1 mL碳酸鎂懸濁液，以防止酸化引起色素溶解。

2.4 儀器設備

配真空泵和玻璃砂芯過濾裝置，玻璃研缽研磨裝置，TDZ5-WS臺式低速離心機，15 mL玻璃刻度離心管(旋蓋材質不與丙酮反應)，752 N紫外可見分光光度計(配10 mm石英比色皿)。

3 建立數學模型

3.1 葉綠素a含量

根據公式1計算葉綠素a含量：

c=

(1)

式(1)中：c為葉綠素a含量,mg/L；A664為試樣在664 nm波長下的吸光度值；A647為試樣在647 nm波長下的吸光度值；A630為試樣在630 nm波長下的吸光度值；A750為試樣在750 nm波長下的吸光度值；V1為提取定容后的體積，10 mL；V2為樣品體積，L；δ為比色皿光程，cm。

3.2 葉綠素a濃度c的相對標準不確定度

由公式(1)可見，被測樣品葉綠素a質量濃度c的合成不確定度，來源于樣品前處理過程中樣品體積(量筒)引入的不確定度u(V1)、樣品提取時定容體積引入(容量瓶)的標準不確定度u(V2)、樣品重復性引入的標準不確定度u(S)、比色皿光程的標準不確定度u(δ)、分光光度計透射比最大允差對測量值引入的標準不確定度u(CT)五個部分。根據不確定度的傳播規律得出葉綠素a質量濃度c的相對標準不確定度，見公式(2)：

(2)

式(2)中：uc(C)為樣品中葉綠素a含量測定的合成標準不確定度；u(V1)為前處理后樣品定容體積引入的標準不確定度；u(V2)為樣品體積引入的標準不確定度；u(S)為測量樣品重復性引入的標準不確定度；u(δ)為比色皿光程引入的標準不確定度；u(CT)為分光光度計透射比最大允差對測量值引入的標準不確定度。

4 不確定度分量的來源分析

由檢測方法和數學模型分析，其不確定度來源有以下幾個方便：①實驗中量取樣品體積(500 mL量筒)引入的不確定度；②樣品經前處理后定容體積(10 mL容量瓶)引入的不確定度；③測量樣品重復性引入的不確定度；④結果測定中分光光度計比色皿光程引入的不確定度；⑤分光光度計透射比最大允差對測量值引入的不確定度。

5 不確定度分量的評定

5.1 樣品體積(量筒)引入的標準不確定度

因本次測得值量取的樣品體積為500 mL，所以選用500 mL量筒量取。500 mL量筒引入的標準不確定度主要來源于玻璃量具的最大允差、溫度變化引起的體積改變。

5.1.1 500 mL量筒允差引入的標準不確定度

500 mL量筒(A級，量出式)最大允差為5.0 mL，屬A類評定，則：

5.1.2 溫度變化引起量筒體積變化的標準不確定度

設溫度變化±3 ℃，水的膨脹系數α=2.1×10-4℃-1，則：

5.1.3 500 mL量筒引入的標準不確定度

500 mL量筒刻度線讀數重復性的不確定度較小，可忽略不計。則500 mL量筒引入的標準不確定度為：

相對標準不確定度為：

5.2 定容體積引入的標準不確定度

定容體積引入的標準不確定度主要來源于玻璃量具的最大允差、溫度變化引起的體積改變。

5.2.1 10 mL容量瓶允差引入的標準不確定度

按A級標準容器要求，10 mL容量瓶允差為0.02 mL，屬A類評定，則：

5.2.2 溫度變化引起容量瓶體積變化的標準不確定度

設溫度變化±3 ℃，水的膨脹系數α=2.1×10-4℃-1，則：

5.2.3 定容體積引入的標準不確定度

10 mL容量瓶定容體積引入的標準不確定度為：

相對標準不確定度為：

5.3 測量重復性引入的標準不確定度

5.3.1 樣品測量值

根據1.3操作步驟對某地表水樣品進行測定(取樣體積500 mL)，測量值為2.40 mg/m3,原始數據見表1，本實例中的不確定度評定以該測量值為對象展開。

表1 樣品原始記錄(取樣量為500 mL)

5.3.2 實驗方法

從近年來的地表水葉綠素q樣品中，選取10組質量濃度值相近的平行雙樣的結果(樣品體積均為500 mL，質量濃度在2～5 mg/m3)，見表2。計算重復性引入的標準不確定度。

5.3.3 評定方法與計算

5.3.3.1 評定方法

通過兩次平行試驗結果，計算出△i分散性標準差s(△i),進而推導出單次試驗結果的標準不確定度Sp(qi),而Sp(qi)正是樣品重復性引入的標準不確定度u(S)。

(2)計算公式如下：

△i=|q1-q2|

(3)

(4)

(5)

(6)

5.3.3.2 計算結果

測量樣品重復性引入的標準不確定度和相對標準不確定度的計算如下。

(1)將每組樣品測量值q1，q2代入公式(3)中，求出20個△i結果。

表2 平行雙樣數據統計

注：n為平行雙樣組次：q1，q2為平行雙樣的兩個測量值

(7)

(4) 再將s(△i)結果代入公式(6)，得到單次結果的標準不確定度：

(8)

(5) 已知測量值為2.40 mg/m3，可得到測量重復性引入的相對標準不確定度為：

(9)

5.4 比色皿光程引入的標準不確定度

JJG178-2007 規定，比色皿光程最大允差為±0.5%，按照B類評定，則比色皿光程引入的相對標準不確定度為：

(10)

標準不確定度為：

u(δ)=1 cm×urel(δ)=1 cm×2.89×10-3cm。

5.5 分光光度計透射比最大允差對測量結果引入的標準不確定度

5.5.1 評定方法

分光光度計透射比的最大允差為T=±0.5%，用討論系統誤差的方法來計算該允差對測量值的影響。以葉綠素a測得值2.40 mg/m3進行評定，由表4可知，該樣品提取液4個波長的平均吸光度值分別為0.016(A664),0.018(A647),0.012(A630),0.004(A750)，將此系列數據代入公式：吸光度A=lg(1/T)中將吸光度換算為透射比T，則樣品提取液測定吸光度換算出的透射比分別為：T664=96.383%,T647=95.940%,T630=97.275%,T750=99.083%。

當透射比增加0.5%時，T+664=96.883%,T+647=96.440%,T+630=97.775%,T+750=99.583%，此時的吸光度值分別為：0.01375，0.01574，0.00977，0.00181。

當透射比減少0.5%時，T-664=95.883%,T-647=95.440%,T-630=96.775%,T-750=98.583%，此時的吸光度值分別為：0.01826，0.02027，0.01424，0.00620。計算結果見表4。

表4 透射比最大允差對測量值引入的不確定度分析計算

5.5.2 分光光度計透射比最大允差對測量結果引入的標準不確定度的計算

由表4可見，當透射比增加0.5%時，測量結果為2.39 mg/m3，當透射比減少0.5%時，測量結果為2.41 mg/m3，因此，可以認為透射比允差造成的不確定度半寬a是對稱分布的。則

則透射比最大允差引入的相對標準不確定度：

6 合成標準不確定度

根據上述分析及計算結果，列出不確定度分量一覽表，見表5。

合成相對標準不確定度：

表5 不確定度分量一覽

當取樣體積為500 mls時，樣品質量濃度c=2.40 mg/m3。可計算出：

7 計算擴展不確定度

取包含因子k=2(約95%置信概率)，則擴展不確定度：

U=kuc(c)=2×0.08 mg/m3=0.16 mg/m3。

8 結論

(1)分析結果可以看出，用分光光度法測定水體葉綠素a，當采樣量為500 mL，測量值為2.40 mg/m3時，測量不確定度結果表示為：(2.40±0.16)mg/m3，k=2。

(2)影響水體葉綠素a含量的測量不確定度分量主要是測量樣品重復性引入的標準不確定度。

(3)采用估算法來評定分光光度計透射比最大允差對測量值引入的不確定度計算結果相對可靠直觀。