基于青蒿素結構單元的二聚體及其抗耐藥瘧疾活性

楊麗君，解小兵，于志，郭新樂 編寫，馮連順，趙峰 審校

（武漢藥明康德新藥開發有限公司，武漢 430073）

1 前言

瘧原蟲是一類單細胞、寄生性生物，可通過受感染蚊子的叮咬傳播，在人體的肝臟中繁殖，然后感染血紅細胞。其中，惡性瘧原蟲、間日瘧原蟲、三日瘧原蟲、卵形瘧原蟲和諾氏瘧原蟲等五種瘧原蟲可使人類感染瘧疾。惡性瘧原蟲(占非洲發病率的99.5%以上)和間日瘧原蟲(占美洲發病率約70%)最為常見，而惡性瘧原蟲(占瘧疾死亡總數的95%以上)最為致命。目前，瘧疾廣泛流行于熱帶亞熱帶發展中國家，是危害最嚴重的傳染性疾病之一，與艾滋病、結核病被認為是全球最重要的三大公共衛生問題。據世界衛生組織(WHO)估計，僅2017年一年，全球共新增2.19億瘧疾病例，43.5萬人因此喪命。抗瘧疾藥物對瘧疾的防控不可或缺。然而，隨著抗瘧疾藥物的長期、廣泛使用，瘧原蟲對幾乎所有現有藥物產生了不同程度的耐藥性。因此，亟需研發新型尤其是對耐藥瘧疾有良好療效的抗瘧疾藥物。

青蒿素是從復合花序植物黃花蒿莖葉中提取的有過氧基團的倍半萜內酯類藥物，青蒿素及其半合成衍生物如二氫青蒿素、蒿甲醚、蒿乙醚和青蒿琥酯具有抗菌、抗腫瘤、抗真菌、抗病毒和抗瘧疾等多種藥理活性。研究發現，青蒿素的過氧基團可在瘧原蟲體內二價鐵離子的作用下裂解產生各種自由基，所產生的自由基再與瘧原蟲蛋白發生絡合形成共價鍵，最終導致瘧原蟲因瘧原蟲蛋白失去功能而死亡。青蒿素具有起效快、療效高(總治愈率高達95%)和毒性低等特點，被WHO譽為“世界上唯一有效的瘧疾治療藥物”。目前，WHO推薦基于青蒿素的聯合療法(ACTs)作為治療瘧疾包括耐喹啉類藥物瘧疾的標準療法，但青蒿素及其半合成衍生物存在著生物利用度低、溶解性差、復發率高和半衰期短等諸多缺點。更為嚴峻的是，耐青蒿素瘧疾已然出現。由于耐藥性問題，目前WHO已不推薦單獨使用青蒿素。

與單核化合物相比，二聚體往往具有更高的活性、更低的毒副作用和更為優秀的理化性質。近年來，藥物化學家設計合成并評價了多種基于青蒿素結構單元的二聚體(圖1)的抗瘧疾活性，發現這類二聚體的活性普遍優于相應的單核化合物。因此，基于青蒿素結構單元的二聚體在近年來引起了科學家的普遍關注。

圖1 各種連接子連接的基于青蒿素結構單元的二聚體

構-效關系(SAR)研究結果表明，連接子的種類(對稱或不對稱的烷基、酯基和醚等)和長度與抗瘧疾活性息息相關。顯然，合理的優化連接子可能會獲得抗瘧疾活性更高的候選物。基于此，本文將按連接子分類重點介紹基于青蒿素結構單元的二聚體在抗瘧疾領域的最新研究進展，并探討SAR，以啟迪藥物化學家更合理的設計此類化合物。

2 烷基連接的青蒿素二聚體

C-10位異丁酸連接的青蒿素二聚體1a和異煙酸氮氧化物連接的二聚體1b(圖2)對氯喹敏感型(CQS) NF54惡性瘧原蟲的半最大效應濃度(EC50)分別為2.4和0.53nmol/L，優于母藥青蒿素(EC50:8.8nmol/L)。進一步研究發現，醇、酯和酮衍生物1c～e(EC50:0.87, 2.0和0.91nmol/L; 青蒿素的EC50為9.0nmol/L)也具有極高的體外抗CQS NF54惡性瘧原蟲活性，且在感染伯氏鼠瘧原蟲的小鼠模型中，含酯二聚體1f,g(口服6mg/kg的二聚體1f,g與18mg/kg的甲氟喹時可延長小鼠23d壽命, 且寄生蟲血癥在檢測限以下)和含砜二聚體1h,i(口服給藥54mg/kg時分別減少99.8%和99.5%寄生蟲血癥)也具有良好的體內活性，但磺酸結構片段對活性不利。向烷基鏈引入羥基也可耐受，如二聚體2a,b(EC50:0.59和3.0nmol/L)也具有良好的體外活性，但繼續引入芳基、硫醚或砜則對活性不利。進一步研究發現，醚鍵(2c)對體內活性有利。在感染伯氏鼠瘧原蟲的小鼠模型中，二聚體1a,b(半數有效劑量/ED50:1.5和0.8mg/kg，口服給藥；4.5和2.0mg/kg，靜脈注射給藥)優于青蒿琥酯(口服給藥和靜脈注射給藥的EC50分別為5.5mg/kg和8.0mg/kg)。在感染伯氏鼠瘧原蟲GFP ANKA的小鼠模型中，所有靜脈注射二聚體3a～g(3×30mg/kg)的小鼠均存活30d以上，且寄生蟲血癥在檢測限以下。當單次口服給藥1×30mg/kg時，所有二聚體3a～g給藥組的小鼠存活期均不次于arterolane馬來酸鹽。在體內毒性研究中，腹腔注射單劑量的青蒿素二聚體1a(在給藥劑量為250mg/kg時未見小鼠死亡，且對小鼠體重無影響)的安全性優于青蒿琥酯和二聚體1b(在給藥劑量為250mg/kg時三分之一的小鼠死亡，且小鼠體重有所降低)。二聚體1a,b和青蒿琥酯的治療指數(最大耐受劑量/ED50)分別為167，156和23，顯然這類二聚體極具發展潛力。

在感染伯氏鼠瘧原蟲ANKA的C57BL/6J雄性小鼠模型中，5個碳原子相連的青蒿素二聚體4(單次口服6mg/kg的二聚體4與18mg/kg的甲氟喹鹽酸鹽)和5 (單次口服7.1mg/kg的二聚體5與21mg/kg的甲氟喹鹽酸鹽)可抑制＞99.5%的寄生蟲血癥，且未見明顯毒性和小鼠行為的改變，說明這類化合物不僅活性高，而且毒副作用低。

進一步研究顯示，在感染伯氏鼠瘧原蟲ANKA的C57BL/6J雄性小鼠模型中，2個碳原子連接的二聚體6及其衍生物7(單次口服5mg/kg的二聚體6或7與15mg/kg的甲氟喹鹽酸鹽)可快速抑制寄生蟲血癥，且抑制率高達＞99.9%。二聚體6a的活性與其光學異構體6b相當，提示手性中心的構型對活性影響較小。對二聚體7而言，苯環間位上的鹵素為高活性所必需，且用甲基代替鹵素將導致活性大幅下降。其中，二聚體6a,b和7a～c具有良好的體內活性，其可延長25～30d感染小鼠壽命，優于蒿甲醚和甲氟喹鹽酸鹽聯合給藥(延長20.3d)或單獨給藥甲氟喹(延長20.3d)。向側鏈引入碳酸基、硫代碳酸基(8)或羰基、肟基(9)也可耐受，且含硫代碳酸基二聚體(X=S)和含肟基二聚體的活性優于相應的含碳酸基或羰基(X = O)二聚體。對二聚體8而言，烷基在R位比芳基更優。在感染伯氏鼠瘧原蟲ANKA的C57BL/6J雄性小鼠模型中，與甲氟喹鹽酸鹽組(18mg/kg，存活17.8d)和蒿甲醚與甲氟喹鹽酸鹽聯合給藥組(6mg/kg蒿甲醚和18mg/kg甲氟喹鹽酸鹽聯合給藥，存活21.5d)相比，二聚體8a組(6mg/kg二聚體8a和18mg/kg甲氟喹鹽酸鹽聯合給藥，存活30d)小鼠的存活時間明顯延長，而二聚體9a,b組(6mg/kg二聚體9a,b和18mg/kg甲氟喹鹽酸鹽聯合給藥，存活60d)不僅存活期進一步延長，而且可完全治愈感染小鼠。值得一提的是，二聚體9b不僅可與甲氟喹鹽酸鹽聯合使用，與苯芴醇聯合給藥時也可完全治愈感染小鼠。顯然，該化合物值得深入研究。

青蒿素二聚體10～12(EC50:0.91～10.5nmol/L)抗耐多藥(MDR) K1惡性瘧原蟲的活性極高，優于母藥青蒿素(EC50:11.7nmol/L)。SAR研究結果表明，連接子與活性息息相關，且長鏈連接子對活性有利。對二聚體10而言，在R位為芳環的化合物10a,b(EC50:2.1和2.3nmol/L)的活性優于相應的烷基衍生物(EC50:3.4～5.0nmol/L)。二聚體11b(EC50:0.91nmol/L)的活性略優于其差向異構體12b(EC50:1.1nmol/L)，提示手性對活性影響不大。進一步研究表明，青蒿素三聚體或四聚體(EC50:2.4～＞20nmol/L)也具有一定的抗MDR K1惡性瘧原蟲活性，但活性弱于二聚體。

3 醚鍵連接的青蒿素二聚體

圖2 烷基連接的青蒿素二聚體1～12的化學結構

醚鍵連接的二聚體13(圖3，IC50:0.3～31.9nmol/L)抗CQS D6和耐氯喹(CQR)W2惡性瘧原蟲SAR研究結果表明，兩個氧原子之間為直鏈或支鏈烷基連接子時優于環烷基連接子。這類二聚體(半數毒性濃度/TC50:＞78nmol/L)對VERO細胞的毒性較低，SI≥21。其中，二聚體13a,b(IC50:0.3～1.3nmol/L)的抗CQS D6和CQR W2惡性瘧原蟲活性是青蒿素(IC50:9.9和15.9nmol/L)和氯喹(IC50:29.7和744.1nmol/L)的9～53和27～2480倍，SI＞6432。進一步研究發現，二聚體13a,b的差向異構體14a,b(IC50:3.8～11.2nmol/L)也具有潛在的抗CQS D6和CQR W2惡性瘧原蟲活性。SAR顯示醚結構片段并非高活性所必需結構單元，將氧原子換做氮原子，二聚體仍具有良好的活性。化合物14c(IC50:3.0和4.2nmol/L)的抗CQS D6和CQR W2惡性瘧原蟲活性是氯喹(IC50:41.6和378.3nmol/L)的13.8和90.0倍，對VERO細胞的TC50＞7075nmol/L。顯然，二聚體13a,b和14c可作為先導物進一步優化。

含有7-氯喹啉藥效團的二聚體15(IC50:5.31～205.4nmol/L)也具有潛在的抗CQS D6和CQR Dd2惡性瘧原蟲活性，但抗CQR Dd2惡性瘧原蟲活性均弱于二氫青蒿素(IC50:2.09nmol/L)。SAR顯示連接子的碳鏈長度對活性有顯著影響，且短鏈連接子優于長鏈連接子。進一步研究發現，用三嗪(16，抗CQS D6和CQR Dd2惡性瘧原蟲的IC50為5.5～35.9nmol/L)代替7-氯喹啉并不能明顯提高活性。代表物15b(IC50:8.70, 5.31和28.43nmol/L)具有優秀的抗CQS 3D7, D6和CQR Dd2惡性瘧原蟲活性，活性是氯喹(IC50:20.00, 21.54和157.9nmol/L)的2.2～5.5倍，且抗CQS D6惡性瘧原蟲活性與二氫青蒿素(IC50:5.11nmol/L)相當。在感染文氏鼠瘧原蟲的小鼠模型中，二聚體15b(靜脈注射和口服給藥的ED50分別為1.4和20mg/kg)靜脈注射給藥的ED50與青蒿琥酯(靜脈注射和口服給藥的ED50分別為＜1和1.8mg/kg)處于同一水平，但口服給藥ED50遠遜于青蒿琥酯。作用機制研究結果顯示，這類二聚體可能通過其活性代謝產物如單青蒿素-喹啉雜合體或無喹啉結構單元的青蒿素二聚體發揮抗惡性瘧原蟲活性。

圖3 醚鍵相連的青蒿素二聚體13～20的化學結構

含有1,2,3-三氮唑的青蒿素二聚體17～19(IC50:＞1μmol/L)的抗CQS 3D7和CQR PKL-2惡性瘧原蟲活性較弱，提示向兩個青蒿素核之間引入1,2,3-三氮唑結構單元對活性不利。

三氧雜環己烷二聚體20具有良好的抗CQS NF54惡性瘧原蟲活性，且IC50在納摩爾級。SAR顯示，與無取代衍生物相比，向R位引入甲基或芐基對活性不利。代表物20a(IC50:1.9nmol/L)的抗CQS NF54惡性瘧原蟲活性是青蒿素(IC50:10nmol/L)的5.2倍，值得進一步開發。

4 酯基連接的青蒿素二聚體

酯基連接的青蒿素二聚體21a,b(圖4, IC50:2.6nmol/L)具有優秀的抗CQS 3D7惡性瘧原蟲活性，其活性與二氫青蒿素(IC50:2.5nmol/L)相當，而是青蒿琥酯和氯喹(IC50:9.0和9.8nmol/L)的4倍左右。SAR顯示，連接子的長度與活性正相關，如長鏈連接子二聚體21c(IC50:1.4nmol/L)具有最高的抗CQS 3D7惡性瘧原蟲活性。向兩個酯基之間嵌入酰胺仍可保持優良的活性，如二聚體22a,b(IC50:0.32和0.30nmol/L)的抗CQS 3D7惡性瘧原蟲活性在亞納摩爾級，且二者的活性約為青蒿琥酯(IC50:0.82nmol/L)的3倍。

磷酸酯連接的青蒿素二聚體23抗惡性瘧原蟲SAR顯示，磷酸酯結構片段對活性至關重要，用烷基酯或芳基酯代替磷酸酯將導致活性降低。二聚體23a,b(IC50:0.09～0.5nmol/L)的抗CQS HB3和CQR K1惡性瘧原蟲活性極高，且化合物23a(IC50:0.09和0.2nmol/L)對所測惡性瘧原蟲活性是青蒿素(IC50:14.5和12.3nmol/L)和氯喹(IC50:20和190nmol/L)的61.5～950倍。進一步研究發現，青蒿素與磷酸酯之間烷基連接子的長度也與活性息息相關，且2個碳最優，延長或縮短碳鏈均會導致活性下降。過氧結構片段是高活性所必需結構單元，去除該結構將導致二聚體失活。二聚體23c(IC50:0.04nmol/L)的抗CQS 3D7惡性瘧原蟲活性明顯高于其衍生物23a,b(IC50:0.2和0.5nmol/L)，提示磷酸酯比亞磷酸酯對活性更有利。二聚體23c即使在濃度高達＞250μmol/L時對人外周血單個核細胞仍未顯示出明顯毒性，治療指數＞6250000。

圖4 酯基連接的青蒿素二聚體21～23的化學結構

5 其它連接子連接的青蒿素二聚體

含有二茂鐵結構片段的青蒿素二聚體24a(圖5, IC50:7.2nmol/L)的抗CQS 3D7惡性瘧原蟲活性略優于氯喹(IC50:9.8nmol/L)，但向二茂鐵和青蒿素之間引入烷基鏈(24b, IC50:29.6nmol/L)將導致活性降低。含有碳酸胺結構單元的二聚體25a(ARB-89)及碳酸酯衍生物25b(ARB-92)不僅對惡性瘧原蟲感染的人血紅細胞具有良好的活性(IC50≤0.50nmol/L)，二者(給藥劑量3.3mg/kg, 寄生蟲血癥的抑制率分別為＞96%和＞99%)在感染伯氏鼠瘧原蟲的CD1小鼠模型中也顯示出優秀的體內活性，優于青蒿琥酯(給藥劑量3.3mg/kg，寄生蟲血癥的抑制率為94%)。毒性研究結果表明，二者無明顯毒性。藥代動力學研究結果表明，ARB-89清除較快(CL:92.8L/h·kg)、半衰期較短(t1/2:1.2h)、口服生物利用度不高(23.4%)，而ARB-92清除較慢(CL:2.9L/h·kg)且半衰期較長(t1/2:2.3h)。ARB-92的口服生物利用度為34%，高于雙氫青蒿素(19.3%)、蒿甲醚(19.7%)和青蒿琥酯(29.5%)，且ARB-92(Cmax:1457ng/mL)的藥峰濃度是ARB-89(Cmax:40.3ng/mL)的36.2倍。總之，ARB-92具有優秀的體內外活性和良好的藥代動力學性質，可作為先導物進一步研究。

圖5 青蒿素二聚體24～27的化學結構

含有苯基的青蒿素二聚體如26a,b也具有潛在的抗惡性瘧原蟲活性，且二者(IC50:1.9和1.7nmol/L)的抗CQS NF54惡性瘧原蟲活性是青蒿素(IC50:7.6nmol/L)的4倍。SAR顯示，用二氟烷基或炔基代替酮將導致活性降低，將對位苯二酮用間位苯二酮(26c, IC50:1.9nmol/L)替代對活性影響不大。移除羰基似乎對活性影響不大，如二聚體27a～c(IC50:1.3, 1.6和0.77nmol/L)也具有良好的抗CQS NF54惡性瘧原蟲活性。

5 結束語

青蒿素及其半合成衍生物對于瘧疾的防控至關重要，但這類抗瘧疾藥物普遍存在著生物利用度低、溶解性差、復發率高和半衰期短等諸多缺點。更為嚴峻的是，耐青蒿素瘧疾已然出現，使得這類藥物的療效呈逐年下降之勢。

與單核化合物相比，青蒿素二聚體往往具有更高體內外抗瘧疾的活性、更低的毒副作用和更為優秀的理化性質。SAR顯示，連接子的種類和長度與抗瘧疾活性息息相關，合理的優化連接子可能會獲得抗瘧疾活性更高的候選物。本文重點介紹了不同連接子連接的的青蒿素二聚體在抗瘧疾領域的最新研究進展，并探討SAR，以啟迪藥物化學家更合理的設計此類化合物。