四氮唑雜合體的抗真菌活性

劉蘭 編寫，黃敏 審校

(武漢大學醫學職業技術學院，武漢 430060)

1 前言

據2018年統計，據統計，每年約有3億人罹患侵襲性真菌感染(IFIs)，超百萬人因此喪命。唑類抗真菌藥物如酮康唑、伊曲康唑和氟康唑等對真菌感染的防治不可或缺，但大多存在耐藥性和毒副作用等問題。因此，開發新型抗真菌藥物勢在必行。四氮唑是羧酸的生物電子等排體，其衍生物具有抗菌、抗腫瘤、抗老年癡呆、抗結核、抗瘧疾和抗真菌等多種生物活性，且某些臨床上使用的藥物如西洛他唑、頭孢唑林、頭孢羥唑和厄貝沙坦等均含有四氮唑結構單元。顯然，四氮唑在新藥研發領域占據重要位置。

雜合體具有降低毒副作用、提高活性和拓展生物活性譜的潛力，是近年來新藥研發的熱點。四氮唑類化合物具有潛在的抗真菌活性，故如將四氮唑與其它抗真菌藥效團雜合可能會進一步提高這類化合物的活性。近年來，藥物化學家設計合成了多個系列四氮唑雜合體，并評價了它們的體內外抗真菌活性。本文將重點介紹該領域的最新研究進展，并歸納構-效關系(SAR)，以期進一步指導科學家合理設計此類雜合體。

2 四氮唑-唑雜合體

2.1 四氮唑-三氮唑雜合體

對一系列四氮唑-1,2,4-三氮唑雜合體1(圖1)及其位置異構體2、光學異構體3和4的體外抗藥敏型和耐藥型白色念珠菌、熱帶假絲酵母、克柔念珠菌、近平滑念珠菌、平滑念珠菌、新生假絲酵母和黑曲霉的活性測試結果表明，這類雜合體的最小抑制濃度(MIC)為0.12～＞16.0μg/mL，高于對照化合物伊曲康唑(MIC:0.007～0.5μg/mL)。SAR研究結果表明，光學活性中心對這類雜合體的抗真菌活性有顯著影響，且含有2R,3S-手性碳的雜合體3(MIC:0.25～＞16.0μg/mL)和4(MIC:0.12～＞16.0μg/mL)比非光學活性的類似物1(MIC:1.0～＞16.0μg/mL)和2(MIC:0.5～＞16.0μg/mL)的活性更高。雜合體1和3的抗真菌活性與其位置異構體2和4相當，提示藥效團的連接方式對活性影響不大。與相應的無取代衍生物相比，向R1位引入甲基可提高這類雜合體的抗真菌活性。向苯環引入氟、氯、硝基和三氟甲基等吸電子基或正丁氧基等供電子基可改善活性，而用吡啶或芐基代替苯基則不能明顯提高活性。其中，代表物4d(MIC:0.12～1.0μg/mL)對所測10株真菌的抑制作用與伏立康唑(MIC:0.015～0.5μg/mL)和泊沙康唑(MIC:0.12～1.0μg/mL)相當，對熱帶假絲酵母、近平滑念珠菌、平滑念珠菌、新生假絲酵母、黑曲霉和耐藥白色念珠菌的活性是氟康唑(MIC:2.0～8.0μg/mL)的16倍。將N4-芳基哌嗪基-N1-乙基去除所得的雜合體5(MIC:100μg/mL)和6(MIC:12.5～100μg/mL)對白色念珠菌僅顯示出弱到中等強度的活性，說明此結構片段對提高體內外活性至關重要。體內外抗真菌SAR研究結果顯示，苯環上的取代基與活性息息相關，其相對貢獻順序為2,4-二氟＞2-氟＞4-氯＞4-氟。其中，雜合體6a(MIC:12.5μg/mL)的活性最高，其抗白色念珠菌活性是對照藥氟康唑(MIC:100μg/mL)的8倍。在白色念珠菌感染的CDF1小鼠模型中，雜合體6a的半數有效量(ED50)為0.18mg/kg，低于氟康唑(ED50:0.29～0.35mg/kg)。總之，良好的體內外活性使得雜合體6a可作為先導物深入研究。進一步研究表明，四氮唑-1,2,4-三氮唑-3-酮雜合體7(ED50:0.71～2.0mg/kg)的體內活性普遍弱于四氮唑-1,2,4-三氮唑雜合體6(ED50:0.18～1.54mg/kg)，提示羰基的引入對活性不利。四氮唑-1,2,4-三氮唑雜合體8(MIC:50和25μg/mL)對白色念珠菌具有中等活性，但弱于對照藥克霉唑和咪康唑(MIC:6.25和3.12μg/mL)。

圖1 四氮唑-三氮唑雜合體1～10的化學結構

1,2,4-三氮唑-3-酮結構片段N-1位含有烷基、環烷基、吡啶基亞甲基和芐基的四氮唑-4-吡啶基-1,2,4-三氮唑-3-酮雜合體9對白色念珠菌Y0109、白色念珠菌SC5314、近平滑念珠菌、平滑念珠菌、新生假絲酵母、紅色毛癬菌、石膏樣小孢子菌和煙曲霉具有潛在的活性，MIC為0.125～＞64μg/mL。SAR顯示，含有大體積疏水性基團的雜合體對念珠菌屬和新生假絲酵母的活性更高，優于氟康唑。雜合體9a～9c(MIC:0.125～4μg/mL)對除煙曲霉外的所有檢測致病真菌均具有良好體外活性，與氟康唑(MIC:0.5～8μg/mL)相當或更優。此外，雜合體9a～9c對人CYP3A4無抑制作用，提示其發生藥物相互作用的風險較低。Kamble等篩選了四氮唑-1,2,3-三氮唑雜合體10的體外抑血管緊張素轉換酶、抗增殖、抗炎和抗真菌活性，發現所有雜合體(在濃度為25μg/mL時的抑菌圈為11～18mm)對黃曲霉、煙曲霉、黑曲霉和白色念珠菌均有潛在的活性，但其活性低于對照藥氟康唑(在濃度為20μg/mL時的抑菌圈為19～22mm)。

2.2 四氮唑-四氮唑雜合體

與相應的單核化合物相比，二聚體和三聚體化合物往往表現出一些獨特的性質，如更高的生物活性，故有必要對四氮唑二聚體和三聚體的抗真菌活性進行研究。四氮唑二聚體11(圖2)對所測黃曲霉、煙曲霉、馬爾尼菲青霉菌和須毛癬菌顯示出良好的活性，MIC為6.25～50μg/mL。SAR表明，N-1位取代基對活性有顯著影響，其順序為芐基＞環丙基≈乙基。代表物11c(MIC:6.25μg/mL)對所測真菌的活性最高，可與伊曲康唑(MIC:6.25μg/mL)相媲美。

含色酮和1,3,5-三嗪的四氮唑三聚體12對白色念珠菌、黑曲霉、煙曲霉和釀酒酵母具有潛在的活性，MIC為＜0.16～2.5μg/mL。SAR顯示，與未取代的雜合體12a相比，向苯環上引入甲基、氯、溴、甲氧基和硝基等取代基并不能明顯提高這類雜合體的抗真菌活性，但羧基對活性有利。其中，代表物12m(MIC:＜0.16～0.625μg/mL)對所測所有真菌具有良好的活性，不遜于對照藥氟康唑(MIC:＜0.16～0.312μg/mL)。

2.3 四氮唑-苯并咪唑雜合體

圖2 四氮唑二聚體11和三聚體12的化學結構

圖3 四氮唑-苯并咪唑雜合體13～15的化學結構

苯并咪唑是藥物分子中的常見藥效團，其衍生物也具有潛在的抗真菌活性，故將其與四氮唑雜合也是研發新型抗真菌藥物的潛在途徑。研究發現，四氮唑-苯并咪唑雜合體13a(圖3)和13b(MIC:25～50μg/mL)的抗白色念珠菌、光滑念珠菌和熱帶念珠菌的活性與酮康唑(MIC:25～50μg/mL)相當。四氮唑-苯并咪唑雜合體14對白色念珠菌、光滑念珠菌、克魯氏假絲酵母和熱帶念珠菌的MIC為4～＞64μg/mL，SAR顯示，向苯并咪唑結構單元引入芳環如4-氯苯基氧基(14a, MIC:16μg/mL)、咪唑(14b, MIC:8～16μg/mL)和1,2,4-三氮唑(14c, MIC:4～8μg/mL)等對活性有利，但所有雜合體的活性均弱于氟康唑(MIC:1～4μg/mL)。四氮唑-苯并咪唑雜合體15(MIC:125～＞1000μg/mL)對白色念珠菌和煙曲霉顯示出弱到中等強度的活性，SAR研究結果表明，R2位的取代基與活性息息相關，且甲氧基優于氫、甲基和氯等。代表物15a(MIC:125μg/mL)的抗真菌活性與制霉菌素(MIC:100μg/mL)相當，對白色念珠菌的活性是灰黃霉素(MIC:500μg/mL)的4倍，值得進一步研究。

2.4 四氮唑-噻(二)唑/噁二唑雜合體

四氮唑-苯并噻唑雜合體16(濃度為250μg/mL時的抑菌圈為13～23mm)對白色念珠菌和黑曲霉顯示出中等強度的活性，但弱于對照藥氟康唑(濃度為100μg/mL時的抑菌圈為25和22mm)，見圖4。SAR表明，向苯環引入供電子基或吸電子基均不能明顯提高活性，提示該位點取代基對活性影響較小。

圖4 四氮唑-噻(二)唑/噁二唑雜合體16～20的化學結構

對四氮唑-苯并噻唑和四氮唑-苯并噁唑雜合體17的體外抗白色念珠菌、黑曲霉、黑色炭疽病菌、接骨木鐮孢和尖孢鐮孢菌活性研究結果表明，四氮唑-苯并噁唑雜合體17e～17h(濃度為64μg/mL時的生長抑制率為4%～46.7%)對黑曲霉、黑色炭疽病菌、接骨木鐮孢和尖孢鐮孢菌的活性優于相應的苯并噻唑類似物17a～17d(濃度為64μg/mL時的生長抑制率為0%～36.7%)。雜合體17e～17h對白色念珠菌的抑制作用盡管弱于氟康唑(濃度為32μg/mL時生長抑制率為17.6%～100%)，但雜合體17b、17d、17g和17h(濃度為0.0313μg/mL時的生長抑制率為98.80%～99.36%)對白色念珠菌的活性極高。

四氮唑-噻唑啉雜合體18(MIC:125～250μg/mL)對寄生曲霉、產黃青霉、哈茨木霉菌、黃曲霉、茄病鐮刀菌、串珠鐮刀菌、大刀鐮刀菌具有潛在的活性，對除產黃青霉外的其它所有所測微生物的活性均不低于酮康唑(MIC:125～500μg/mL)。SAR研究發現，R1和R2位的取代基幾乎不會影響這類雜合體的抗真菌活性。

四氮唑-噻二唑雜合體19也顯示出潛在的抗真菌活性，其在濃度為50μg/mL時對茄鏈格孢、灰霉菌、褐斑病菌、小麥赤霉病菌、馬鈴薯晚疫病菌、蘋果輪紋病菌、水稻紋枯病菌、核盤菌和禾谷絲核菌的生長抑制率為20.00%～65.38%。四氮唑-1,3,4-噁二唑雜合體20對革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、結核分枝桿菌和真菌具有廣譜抗菌活性，對白色念珠菌和黑曲霉的MIC分別為50和100μg/mL，略弱于對照藥霉可唑(MIC:25和12.5μg/mL)。

2.5 四氮唑-吡唑/硒代咪唑雜合體

吡唑類化合物具有多種生物活性，且某些臨床上使用的藥物如塞來昔布、安替比林和苯丁氮酮等均含有吡唑結構片段。因此，有必要將吡唑與四氮唑雜合。

四氮唑-苯并吡唑雜合體21(圖5)在濃度為500μg/mL時對白色念珠菌和黑曲霉的抑菌圈為11～20mm，但弱于酮康唑(濃度為50μg/mL時的抑菌圈為23mm和26mm)。與未取代的類似物相比，氯、硝基和三氟甲基等吸電子基的引入對抗真菌活性有利，而供電子的甲基和甲氧基則會導致活性的降低。

絕大多數四氮唑-1,2,3-硒二唑雜合體22對白色念珠菌和黑曲霉的活性較弱，MIC為100～400μg/mL，但活性最高的雜合體22b和22c(MIC:6.25μg/mL)對白色念珠菌的活性與氟康唑(MIC:6.25μg/mL)相當。

3 四氮唑-喹啉/喹諾酮雜合體

喹啉和喹諾酮類化合物不僅在抗瘧疾和抗菌領域發揮著重要作用，這類化合物也具有潛在的抗真菌活性。因此，將喹啉/喹諾酮藥效團與四氮唑雜合是開發新型抗真菌藥物的有效途徑。

圖5 四氮唑-苯并吡唑21和四氮唑-硒代咪唑雜合體22的化學結構

圖6 四氮唑-喹啉/喹諾酮雜合體23～36的化學結構

含有羅丹明結構片段的四氮唑-喹啉雜合體23(圖6)和24(MIC:25～150μg/mL)對白色念珠菌、黑曲霉、黃曲酶、新型隱球菌和尖孢鐮孢菌具有潛在的活性，但弱于咪康唑(MIC:12.5～25μg/mL)。SAR表明，與無取代基的雜合體23相比，含有羧基的雜合體24對白色念珠菌、黃曲酶和尖孢鐮孢菌的抑制活性較高。連接子的長度對抗真菌活性也有一定影響，且短連接子(n=1)比長連接子(n=2)對活性有利。其中，代表物24b(MIC:25～50μg/mL)對白色念珠菌、黃曲酶、新型隱球菌和尖孢鐮孢菌的抗真菌活性與咪康唑相當。進一步研究發現，磷酸乙酯(25, MIC:10～25μg/mL)、查爾酮(26, MIC:25～175μg/mL)、吡唑啉(27, MIC:25～100μg/mL)和噁唑啉(28和29, MIC:25～100μg/mL)可替代羅丹明片段，且這些藥效團對活性的貢獻順序為磷酸乙酯＞噁唑啉≈吡唑啉≈羅丹明＞查爾酮。值得一提的是，活性最高的雜合體25g和29e(MIC:10和25μg/mL)對白色念珠菌和黃曲酶的活性與灰黃霉素(MIC:10μg/mL)和氟康唑(MIC:25μg/mL)相當，極具進一步開發前景。

四氮唑-喹啉雜合體30～32具有良好的體內抗炎和體外抗菌活性，但抗白色念珠菌活性(MIC:≥100μg/mL)遠低于克霉唑(MIC:12.5μg/mL)。含有苯并咪唑結構單元的四氮唑-喹啉雜合體33對白色念珠菌也顯示出潛在的活性(濃度為125μg/mL時的抑制圈為7～12mm)，其活性略低于氟康唑(抑制圈:14mm)。

大多數四氮唑-喹啉雜合體34(MIC:2.5～50μg/mL)及其位置異構體35(MIC:2.5～50μg/mL)的抗白色念珠菌和煙曲霉活性優于對照品氟康唑(MIC:30μg/mL)，但雜合體34與其位置異構體35之間沒有顯著差異，提示連接模式對這類雜合體的抗真菌活性影響較小。雜合體34b、34d、34f、34h、35d, 35f和35h(MIC:10μg/mL)對白色念珠菌的活性是氟康唑的3倍，而雜合體34j和35j(MIC:2.5μg/mL)對煙曲霉的活性則是氟康唑的12倍。

四氮唑-萘啶酮雜合體36(MIC:6.25～100μg/mL)對白色念珠菌、黑曲霉、黃曲霉、印度毛霉和少根根霉具有顯著的抑制活性，且苯環上含吸電子的氟(36d，MIC:6.25μg/mL)和硝基(36g，MIC:6.25μg/mL)時能改善對黑曲霉的抑制活性。

4 四氮唑-吡啶雜合體

四氮唑-吡啶雜合體VT-1161(37a，圖7)是一種對隱球菌具有優秀體內外活性的真菌特異性cyp51抑制劑，目前正處于抗真菌III期臨床試驗階段。VT-1161具備成為復發性外陰陰道念珠菌病(RVVC)患者最佳治療選擇的藥物潛力，并有望成為FDA批準的治療該常見疾病的首款藥物。VT-1161的衍生物VT-1129(37b)是一種潛在的口服抗隱球菌感染藥物，本品在隱球菌性腦膜炎小鼠模型中顯示出良好的體內療效(與氟康唑相比小鼠的存活期延長了30d)，被FDA視為治療隱球菌性腦膜炎的潛在藥物。目前，VT-1129正在美國進行I期臨床試驗，從已報道的結果可知，該雜合體具有優秀的抗真菌活性。

四氮唑-吡啶雜合體38(濃度為50μg/mL的抑制圈為10～19mm)對白色念珠菌和煙曲霉的活性均低于酮康唑(濃度為10μg/mL的抑制圈為23和24mm)。研究發現，與未取代的雜合體相比，向苯環上引入鹵素原子氯或溴可提高抗真菌活性。鹵素原子的個數也在一定程度上影響抗真菌活性，雙氯雜合體38j(濃度為50μg/mL的抑制圈為16和18mm)的抗真菌活性高于相應的單氯化合物38c(濃度為50μg/mL的抑制圈為15和17mm)。代表物38b(濃度為50μg/mL的抑制圈為17和19mm)對白色念珠菌和煙曲霉的活性最高，可作為先導物進一步研究。

5 四氮唑-嘧啶雜合體

圖7 四氮唑-吡啶雜合體37和38的化學結構

圖8 四氮唑-嘧啶雜合體39～44的化學結構

嘧啶是細胞的基本代謝產物，且嘧啶基團也是許多藥物的藥效團。因此，四氮唑-嘧啶雜合體可能是潛在的抗真菌候選物。四氮唑-嘧啶雜合體39(圖8)(MIC:＜0.16～5μg/mL)對白色念珠菌、煙曲霉、黑曲霉和釀酒酵母具有良好的抑制作用，SAR顯示向苯環無論引入供電子基還是吸電子基均可提高這類雜合體的抗真菌活性。含有氫鍵供體--羥基的雜合體39i(MIC:＜0.16～0.625μg/mL)對煙曲霉、黑曲霉和釀酒酵母的活性是氟康唑(MIC:0.625～2.5μg/mL)的2倍以上，提示氫鍵供體可能對這類雜合體的抗真菌活性有利。

抗菌和抗真菌評價結果表明，四唑并[1,5-a]嘧啶雜合體40d(MIC:7.81～62.5μg/mL)和40e(MIC:3.91～62.5μg/mL)對所測所有微生物具有顯著活性，但其余雜合體則未顯示出任何活性。值得一提的是，雜合體40e(MIC:3.91～7.81μg/mL)對革蘭陽性和革蘭陰性細菌(包括耐藥菌株)均具有較高的活性，其對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的活性是甲氧西林(MIC:250μg/mL)的64倍以上。雜合體40e(MIC:62.5μg/mL)對白色念珠菌具有中等水平的抑制活性，但遠弱于對照藥兩性霉素B(MIC:0.48μg/mL)。雜合體41和42(在濃度為100μg/mL時的抑菌圈為6～22mm)對白色念珠菌也顯示出潛在的抑制作用，其中活性最高的化合物41d(在濃度為100μg/mL時的抑菌圈22mm)略優于制霉菌素(在濃度為100μg/mL時的抑菌圈21mm)。四氮唑-嘧啶酮雜合體43(在濃度為1mg/mL時的抑菌圈1.8～2.5mm)對黃曲霉、煙曲霉和黑曲霉的抑制活性與制霉菌素(在濃度為1mg/mL時的抑菌圈2.4～2.8mm)相當。化合物44(MIC:50～400μg/mL)對白色念珠菌和黑曲霉顯示出弱到中度的活性，且活性遠低于氟康唑(MIC:6.25μg/mL)。

6 其它四氮唑雜合體

四氮唑-查爾酮雜合體45(圖9)對白色念珠菌、煙曲霉、黑曲霉和灰色孢囊放線菌具有較高的活性(MIC:＜0.16～10μg/mL)，但對紅籠頭菌(MIC:10～＞80μg/mL)僅顯示出弱到中等強度的活性。SAR表明，用吡啶基取代苯環將會導致活性的急劇降低。與雜合體39相似，氫鍵供體-羥基的引入可提高其抗真菌活性。代表物45i(MIC:＜0.16～1.25μg/mL)對白色念珠菌和灰色孢囊放線菌的活性與氟康唑(MIC:＜0.16和1.25μg/mL)相當，對煙曲霉和黑曲霉的活性是氟康唑(MIC:0.625和2.5μg/mL)的4倍。四氮唑-黃酮雜合體46(MIC:12.5～50μg/mL)對白色念珠菌、平滑念珠菌和熱帶念珠菌具有潛在的活性，其對平滑念珠菌和熱帶念珠菌的活性是咪康唑(MIC:400和800μg/mL)的8～64倍。SAR顯示，與無取代化合物46a相比，向C-6或C-8位引入氯基和甲基不會顯著增強活性，但第二個氯的引入會導致活性降低。雜合體46a，46b和46f(MIC:12.5～25μg/mL)對白色念珠菌的活性與咪康唑(MIC:12.5μg/mL)相當，對平滑念珠菌和熱帶念珠菌的活性是咪康唑的16～64倍。因此，這三個雜合體都具有進一步研究價值。

圖9 四氮唑雜合體45～47的化學結構

除上述雜合體外，四氮唑-雌酮、四氮唑-腙、四氮唑-吡咯、四氮唑-β-內酰胺、四氮唑-內酯、四氮唑-噠嗪、四氮唑-香豆素和四氮唑-安布羅替星雜合體也顯示出某種程度的抗真菌活性，其中某些雜合體如47(對黃曲霉和煙曲霉的MIC為1.5μg/mL)的活性極高，但絕大多數此類雜合體的活性遠低于目前使用的抗真菌藥物，仍需進一步優化。

7 結論

侵襲性真菌感染是嚴重威脅人類生命健康的致死性傳染病，每年全球每年超過百萬人因此喪命，給世界各國醫療衛生系統帶來了沉重的負擔。目前，臨床上使用的抗真菌藥物普遍存在著療效不理想和毒副作用大等諸多缺點，而耐藥真菌的出現和廣泛傳播使真菌感染的治療變得更加復雜。因此，開發新型抗真菌藥物迫在眉睫。

四氮唑具有廣譜生物活性，在新藥開發中發揮著重要作用。四氮唑具有潛在的抗真菌活性，故將四氮唑與其它具有抗真菌活性的藥效團雜合具有提高活性、降低毒副作用和克服耐藥性的潛力。在過去的三十年中，科學家經過不懈的努力已經篩選出多種具有優秀體內外抗真菌包括耐藥真菌活性的四氮唑類化合物。其中，VT-1161和VT-1129是該領域的杰出代表。目前，二者正處于治療真菌感染的臨床試驗中，有望于不久的將來為人類健康服務。

本文綜述了近年來四氮唑雜合體在抗真菌領域的最新研究進展，并歸納了其構-效關系，豐富的構-效關系可為進一步合理設計活性高、毒性低、作用機制多樣的四氮唑雜合體奠定基礎。