不同芽孢桿菌屬重組生物藥物的制備及前景展望

朱瑜 編譯，趙晨 審校

(成都大學四川抗菌素工業研究所，成都 610052)

1 前言

現在，約20%上市藥是生物制藥，這是因為生物制藥生產效率比傳統小分子藥物高得多，預計2020年，全球生物醫藥市場預計將達到3060億美元。北美是生物制藥的最大市場，2012年銷售額為636億美元，其中單克隆抗體占大多數(246億美元)，其次是激素(161億美元)和生長因子(81億美元)。20世紀70年代重組DNA技術的發展，利用相對廉價的微生物宿主系統，實現了生物藥物生產的可控性和可擴展性。目前，用于生物制藥的宿主有哺乳動物細胞(39%)，雜交瘤細胞(11.2%)，酵母菌(18.5%)和革蘭陰性菌，如大腸埃希菌(29.8%)等。

此外，工業化生產和分泌藥物相關蛋白的最佳候選菌株是芽孢桿菌菌株。芽孢桿菌呈棒狀，為好氧或兼性厭氧菌，屬于革蘭陽性菌，已經被開發和構建為工業生產菌株，主要用于天然藥物的生產：一些蛋白酶如堿性蛋白酶(枯草芽孢桿菌)、α-淀粉酶(地衣芽孢桿菌)、β-葡聚糖酶(枯草芽孢桿菌)、抗生素、桿菌肽(地衣芽孢桿菌)，內毒素類殺蟲劑(蘇云金芽孢桿菌)，維生素B2(枯草芽孢桿菌)、維生素B12(巨大芽孢桿菌)，多聚γ-谷氨酸補劑或泛醌生物聚合物納米載體(地衣芽孢桿菌)。芽孢桿菌在重組生產藥物相關蛋白方面的巨大優勢，使之在制藥行業中應用廣泛。

與真核表達系統相比，芽孢桿菌易培養，生長速度快，培養時間短；大多數屬非致病性菌株，不含外毒素、內毒素，具有良好的醫藥應用價值。在生物制藥領域內甚至普遍認為枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌是安全菌株。此外，革蘭陽性菌芽孢桿菌能直接將重組蛋白分泌到細胞外培養基中，下游純化成本更低。相比之下，革蘭陰性菌如研究最多的大腸埃希菌，常常在細胞內積累不溶性蛋白形成包涵體導致細胞毒性，錯誤折疊或二硫鍵缺失的蛋白質，都將導致下游加工成本的增高(圖1)。

然而，由芽孢桿菌產生的真核外源蛋白水平比相應原核蛋白的水平要低得多，例如分泌的α-淀粉酶濃度為3g/L。產量低的限制因素可能有：與細胞膜、細胞壁結合相關的蛋白酶由于折疊效率低而被降解；沒有合適的分子伴侶導致前體蛋白質折疊成無效構象；分泌過量并堆積引起產物抑制導致終產量下降，其過量水平取決于目的蛋白和其他蛋白的分泌水平，如合成與分泌之間復雜的反饋機制，其中主要因素為翻譯水平的調控。為了促進重組蛋白高效生產分泌，必須認識、消除這些限制因素。為此，對基因、mRNA轉錄、蛋白質、代謝物、各通量和調控水平進行系統分析至關重要。如今，高通量技術(又稱通量組學方法)可設計構建不同的芽孢桿菌菌株，轉化為高水平表達菌株，以此作為大規模生產藥物相關蛋白產品的重要載體。

本文調查了關于芽孢桿菌生產的藥用重組蛋白的研究現狀，例如高價值藥物如抗體片段和胰島素前體等。為了進一步改進芽孢桿菌的重組生產工藝，需要對其進行整體觀察，可利用基因組學、轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學或通量組學技術來研究問題。因此，本綜述的第二部分揭示了系統生物學和通量組學技術的最新發展，這些技術是系統地提高重組蛋白產量的有效工具，能將其應用于芽孢桿菌菌株生產重組藥物。

2 不同芽孢桿菌菌株重組生產和分泌的藥物相關蛋白

表1～7總結了由芽孢桿菌產生的相關重組蛋白如抗體片段(表1)、人表皮生長因子與人生長激素(表2)、人干擾素和白細胞介素(表3)、胰島素前體(表4)、青霉素G酰化酶(表5)、葡萄球菌激酶和鏈激酶(表6)，及鏈霉親和素(表7)。

2.1 抗體片段

抗體是醫學研究中的重要工具，可與特異性抗原結合被用于分析、蛋白質組研究、疾病的診斷和治療。與抗原具有高親和力的最小常規抗體片段包括抗原結合片段(Fab)、單鏈抗原結合片段(ScFab)和單鏈抗體片段(ScFv)。它們是分別由抗體重鏈和輕鏈組成的抗原結合區域和可變結構域組成的異二聚體，通過連接肽連接穩定其分子結構。通過重組短芽孢桿菌，可分泌約100mg/L抗人尿激酶型纖溶酶原激活劑Fab，還有研究表明，重組枯草芽孢桿菌也可以產生抗溶菌酶和熒光素的ScFv融合蛋白。通過搖瓶培養重組巨大芽孢桿菌 MS941，能產生390μg/L抗CRP ScFv、410μg/L抗溶菌酶D1.3 ScFv、3.5μg/L結構更為復雜的D1.3 ScFab。通過重組木糖代謝缺陷的巨大芽孢桿菌YYBm1菌株，D1.3 ScFv在搖瓶中的分泌量可提高至700μg/L，在3L反應器中可達1.5～4mg/L；通過振蕩分批補料培養，D1.3 ScFv的分泌量可達11.9mg/L；應用優化的木糖誘導啟動子構建質粒時，在搖瓶或反應器中其分泌量可以達到7～11mg/L、在微孔板中甚至達到14±1mg/L。該質粒原本設計用于在巨大芽孢桿菌中D1.3ScFv的重組生產，后研究表明在地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌中也能有效應用。在微孔板、搖瓶和生物反應器中培養重組地衣芽孢桿菌MW3，分泌量可達12～17mg/L。重組枯草芽孢桿菌菌株大部分為菌株168的突變體，其蛋白酶基因缺失且胞外蛋白酶活性較低，與野生型相比，產率大大提高。據報道3種蛋白酶缺陷型重組枯草芽孢桿菌WB30中抗地高辛的單鏈抗體分泌量為3.5mg/L，6種蛋白酶缺陷的重組枯草芽孢桿菌WB 600中可達5mg/L。加入合適的分子伴侶，ScFv 產量可以達到12mg/L。在枯草芽孢桿菌WB800HM [pEPP]菌株中，如果加入分子伴侶，并失活細胞壁相關蛋白酶WprA基因，Scfv產量可達15mg/L。比較重組枯草芽孢桿菌168、WB30和WB600，無論是在微孔板、搖瓶或生物反應器中培養，都可發現蛋白酶分泌較少時將會增加ScFv的穩定性。由8種蛋白酶基因缺陷型WB800N分泌量可達132±9mg/L，這是迄今為止已知的革蘭陽性細菌生產重組抗體片段的最高水平(表1)。

2.2 人生長因子

人表皮生長因子(hEGF)是一種6kDa的多肽，具有3個二硫鍵，能促進表皮和上皮組織的增殖。糖尿病患者通常生長因子濃度偏低，患者可通過注射hEGF治療糖尿病足潰瘍，促進傷口愈合。在重組芽孢桿菌HPD31中，hEGF的產量一般可達到0.24～1.8g/L。在20L攪拌生物反應器分批培養，hEGF產量能達到1.5g/L。在2種蛋白酶缺陷的重組枯草桿菌DB104中，hEGF分泌量可達15mg/L(表2)。

人生長激素(hGH)是一種陰離子、非糖基化的四螺旋束蛋白，分子量為22kDa。目前，產自重組大腸埃希菌的hGH可用作治療侏儒癥、損傷、骨折、潰瘍出血和燒傷。芽孢桿菌菌株作為hGH表達宿主的應用：在復合培養基中培養時，重組短芽孢桿菌31-OK分泌量可達240mg/L；缺失中性蛋白酶基因的重組枯草桿菌N325在搖瓶培養可分泌48mg/L的hGH；用重組枯草芽孢桿菌BGSC在分批培養中hGH的產量能達到70±3mg/L。在1.1～2.4L規模的生物反應器中，采用連續指數補料方式，按照特定生長速率，hGH產量甚至能達到127和497mg/L。

2.3 人干擾素和白細胞介素

人干擾素是天然防御的信號蛋白，與特定的受體結合，可激活抗病毒、免疫調節和抗增殖的信號轉導通路，用于抗病毒、細菌、有絲分裂原和腫瘤細胞。干擾素可用于治療多發性硬化癥，乙型肝炎，丙型肝炎和癌癥。已有研究闡述了在復合培養基中培養的不同重組枯草桿菌菌株分泌α、β和γ-干擾素的情況：在搖瓶中，使用具有低外源蛋白酶活性的菌株IH6140能分泌1～2U/mL的α-干擾素；SAN 780菌株和Dpr8的α-干擾素的分泌量分別為4.4和14.8± 0.4mg/L；用蛋白酶基因缺陷株GB 500和DB 104分泌15mg/L的α-干擾素；在1.1～1.3L的生物反應器中，枯草芽孢桿菌P.amy α-2,6可在分批、連續培養方法分泌7×104-4×105U/mL；利用重組枯草桿菌N325，能分泌8×10-4U/mL的β -干擾素；還有研究表明，用Drp 3和D8PA菌株，能分泌0.8～1U/mL的β-干擾素、3.9～10.1U/mL的β-干擾素前體。在6種蛋白酶缺陷菌株WB600中，培養上清液中能分泌共表達20.3±0.8mg/L，200±39μg/L的γ-干擾素(表3)。

人類白細胞介素是一大類免疫調節信號蛋白，與細胞表面的高親和力受體結合，激活細胞增殖等復雜的免疫反應如免疫細胞的成熟、遷移和黏附等。大腸埃希菌中產生的重組白細胞介素通常與其他藥物聯合使用進行免疫治療，用于治療癌癥或感染。利用復合培養基中培養的重組芽孢桿菌產生白細胞介素：短芽孢桿菌 HPD 31和31-OK，可分泌高達120mg/L白介素-2(15.4kDa)、200mg/L白細胞介素-6(26KDa)。應用8種蛋白酶缺陷枯草芽孢桿菌菌株WB 800，能表達約100mg/L白介素-3(15KDa)(表3)。

2.4 胰島素前體

芽孢桿菌屬的菌株也用于生產前胰島素原和胰島素原(胰島素前體)。前胰島素原是分子量為12kDa，具有3個二硫鍵的單鏈非糖基化多肽，由C肽與N端信號肽連接的A鏈和B鏈組成。去除9kDa的信號肽，可得到胰島素原。可以通過酶切去除C肽，胰島素原進而轉化為胰島素，用于治療糖尿病。在20L生物反應器中，重組短桿菌HPD 31通過分批培養方法，能生產約50mg/L胰島素原(B鏈(1-29)-A鏈與EGF融合)。使用重組枯草芽孢桿菌AJ 73，LB培養基中胰島素原的分泌量達165U/mL；在重組枯草桿菌168的孢子表面也能表達胰島素原；重組枯草桿菌菌株BS273，用固定化細胞在搖瓶和連續生物反應器中培養也可得到12.5mg/L大鼠胰島素原；即使是在1.1L最小培養基間歇培養重組枯草芽孢桿菌BB81.3，可分泌870mg/L的胰島素原(表4)。

表1 喬南芽孢桿菌、短芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌，巨大芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌生產的抗體片段(不完全)

表2 短芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌生產的人類生長因子(不完全)

表3 短芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌生產的人干擾素和白細胞介素-2(不完全)

2.5 青霉素G酰化酶

青霉素G酰化酶(Pac,EC 3.5.1.11)可催化青霉素G和頭孢菌素G裂解為生產半合成β-內酰胺類抗生素的重要中間體。Pac由一個小的α亞基(27KDa)和一個大的β亞基(59KDa)組成，由含有信號肽和間隔肽的單鏈多肽的前體自身催化生成。在芽孢桿菌屬中，巨大芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌可用于各種表達系統以及主要是復合培養基重組生產Pac。突變體中，巨大芽孢桿菌青霉素G酰化酶(BmPac)的生產可高達20.4U/mL、枯草芽孢桿菌MI 113中達5.8U/mL；主要胞外蛋白酶、木糖代謝缺陷型菌株巨大芽孢桿菌YYBm1，使用木糖誘導型質粒系統，BmPac產量最多可分別達到47U/mL(微孔板)、1.5U/mL(搖瓶)、1.25U/mL(實驗室攪拌生物反應器)。枯草芽孢桿菌噬菌體Phi105在溫度敏感表達系統中，搖瓶中分泌2.55U/mL，在連續生物反應器中2.7U/mL，在三相流化床鼓泡塔中可達4U/mL。采用生物反應器中的間歇培養方法，重組的6種蛋白酶缺陷株枯草芽孢桿菌WB 600，糞產堿菌可分泌378U/mL的Pac(AfPac)；具有位點定向突變(BmPacb24F)的菌株可分泌0.92U/mL的BmPac(BmPacb24F)。使用相同的菌株，在補料分批培養中分泌可高達1960U/mL的糞產堿菌青霉素G酰化酶(AfPac)。用其它重組枯草桿菌菌株或質粒系統，可分泌2.2U/mL的粘節桿菌青霉素G酰化酶(AvPac)和0.26U/mL或42U/mL的巨大芽孢桿菌青霉素G酰化酶(BmPac)，見表5。

表4 短芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌生產的胰島素前體(不完全)

表5 巨大芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌生產的青霉素G酰化酶(不完全)

2.6 葡萄球菌激酶和鏈激酶

葡萄球菌激酶(SAK)是由金黃色葡萄球菌分泌的一種不含二硫鍵的15.5kDa多肽。SAK與纖溶酶原的復合結合產生活性纖溶酶，降解血漿蛋白如纖維蛋白。因此，采用重組SAK作為溶栓藥物治療急性心肌梗死和預防血栓形成。已有研究表明重組蛋白酶缺陷型枯草芽孢桿菌在復合培養基中培養的SAK分泌情況；2種酶基因缺陷菌株DB 104，表達約25mg/L的SAK；7種蛋白酶基因缺陷菌株WB700和LB700，分泌可增加至120和181mg/L；WB700菌株在生物反應器中采用分批補料法，產率進一步提高到255和337mg/L(表6)。

SAK僅在纖維蛋白誘導時活化纖溶酶原，SEK則能在纖維蛋白及液相中均可活化纖溶酶原(非纖維蛋白特異性)。分子量為47kDa的鏈激酶最初由幾種鏈球菌產生，同樣用于治療急性心肌梗死和血栓形成。來自于鏈球菌的鏈球菌屬枯草桿菌GSB26可分泌150U/mL的SEK；枯草芽孢桿菌168和蛋白酶基因缺陷菌株DB194、WB428、WB500和BB600也可用于SEK生產(表6)。

2.7 鏈霉親和素

鏈霉親和素(SAV)是一類由阿維丁鏈霉菌產生的胞外四聚體蛋白，分子量約60kDa。SAV每個亞基都具有生物素結合位點，其結合具有高度特異性，因此，SAV被廣泛應用于多種診斷性檢測，具有靶向治療的潛力。使用2種蛋白酶缺陷型枯草芽孢桿菌BE1510，在復合培養基中SAV的分泌量可達30～50mg/L，使用8種蛋白酶缺陷型芽孢桿菌WB800分泌量達35～50mg/L。使用7種蛋白酶缺陷型芽孢桿菌WB700SpoⅡG，采用半組合培養基與復合培養基培養方法分泌量分別達到24mg/L和90mg/L。同時使用8種蛋白酶缺陷型WB800菌株還能夠產生其他不同類型的SAV(表7)。

3 系統生物學及其最新發展

為探究生物機體整個系統、重組蛋白在細胞中的生產過程并優化，需要采用精確的定量分析方法對整體進行研究，因此需要同時記錄機體的不同組分(基因、轉錄產物、蛋白質、代謝物、代謝途徑等)的情況。然而，生命不是靜態的，了解機體的整體調控網路、協調它們在體內的相互作用以及探究不同生物成分是如何在一個整體發揮作用是很重要的。為此，系統生物學作為一門整合性科學產生了，它將經典生物學研究方法結合多門學科、利用信息學方法，評估機體各組分的相互作用和動態調控。

生物系統與其功能的研究需要高通量組學技術和先進計算方法的支持，實現大量實驗數據的獲得和處理。為了探究生物體的整體調節，系統生物學以多種方式系統地干擾生物體，記錄不同水平下的變化：包括基因表達(轉錄組)，蛋白質生產(蛋白質組學)，代謝物的修飾(代謝組學)，通路間的相互作用(通量組學)。將收集的數據整合起來，代入已知或假設的計算模型中，有助于其迭代精煉。將生成的數據和潛在的生物相互作用建立數據庫，對未發現的代謝途徑、遺傳信息和相互作用模式進行索引，用于研究潛在瓶頸以期達成目標。

系統生物學的另一個轉折點是自動化和標準化遺傳工具的迅速發展，實現了快速測序、基因敲除、插入或誘變。此后，通過改變非生物條件或針對性地改變生物體的內在作用，實現系統干擾用于研究特定的調節途徑。盡管在計算精密度和覆蓋度等方面仍存在一些挑戰，系統生物學已經在許多方面擴展了細胞學和生理學知識，可以有效收集并處理這些組學數據。能否克服這些挑戰很大程度上取決于其他研究領域如計算機科學、生化工程、物理學和化學等學科的突破。

表6 枯草芽孢桿菌生產的葡萄球菌激酶和鏈激酶(不完全)

表7 枯草芽孢桿菌生產的鏈霉親和素(不完全)

總之，系統生物學是一門很有前景的學科，在學術研究和工業應用方面都能得到廣泛應用，例如可應用于芽孢桿菌研究。受試菌能夠幫助預測遺傳操縱和誘導的代謝干擾等如何影響表型，例如重組蛋白的生產分泌和副產物的形成。因此，它還將在改進芽孢桿菌工業生產抗體片段、生長因子或激酶等重組生物藥物方面發揮重要作用。通過系統生物學方法，不用隨機誘變，通過合理設計新型工業微生物就能生產高產量的相關蛋白質，簡化培養條件，避免產生不必要的副產物。最后，重組芽孢桿菌菌株可以成為經遺傳改造以適應生產過程的先驗菌株。

3.1 基因組學和轉錄組學

根據過去30年來測序技術的快速發展，基因組測序變得更便利。對用于生產的芽孢桿菌菌株進行測序，尤其是用于生產重組蛋白的菌株，如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌。隨著每個月就能完成一個新的細菌基因組的完全測序，生物研究已進入后基因組時代，將收集到的遺傳信息轉化為遺傳功能用于描述微生物的動態過程。對細胞在特定生理條件下存在的整套轉錄子進行定性及定量被稱為轉錄組學，它是獲得新的基因的功能和調節的有效方法。從發展歷程看，基因表達首先是用Northern雜交方法進行分析，包括電泳和標記互補探針雜交；隨后，逆轉錄酶的發現將mRNA轉化為其互補DNA(cDNA)實現了定量實時逆轉錄聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)的發展。qRT-PCR是目前最靈敏的RNA定量技術，然而，qRT-PCR是一種基因特異性方法，在基因組規模上監測基因表達水平需要花費大量的時間和精力。

約30年前發展起來的DNA微陣列技術提供了簡單可靠的方法，能識別、量化多達數千個基因的表達水平。這是在一項針對枯草芽孢桿菌的全面研究中實現的，該研究涉及到生物體在自然界和蛋白質生產過程中可能受到的各種不同條件的影響。然而，微陣列存在一些缺點，它僅限于給定的探針而不能捕捉整個轉錄組的復雜性。這些DNA探針可能存在交叉雜交，如出現類似于目標序列的轉錄本會影響信號可靠性。此外，實驗設置也會影響結果，計算是相對的，動態范圍受信號飽和的內在限制和背景噪聲的限制。最重要的是，這項技術依賴于正在調查的基因組序列的知識，因此并不普遍適用于非模式生物或特定菌株，例如用于生產重組蛋白的菌株芽孢桿菌。因此，RNA-seq，一種最近發展起來的基于下一代測序技術的高通量技術，克服了大部分限制，并預計未來幾年將優于微陣列技術。這項技術已用于分析不同枯草桿菌mRNA的衰變。

3.2 蛋白質組學

雖然轉錄組分析給出了在特定環境條件下基因表達的全面概述，檢測到的mRNA轉錄子只是基因和蛋白質之間的中間產物。相反，蛋白質承擔從催化到基因調節的大部分細胞功能，包括核苷酸和氨基酸循環、信號轉導和結構穩定。但由于轉錄后的調節和蛋白酶的活性，很難從轉錄水平推斷它們的濃度，必須用專門的方法測定它們的濃度。

蛋白質組學為了解決這一問題，開發新的分析和計算技術，以檢測、識別和量化給定樣本中的整套蛋白質，即蛋白質組。蛋白質組學的研究范圍還包括翻譯后修飾以及蛋白質定位、相互作用和結構的詳細表征，充分研究它們的生物學功能。經過詳細研究表明，現有的分離和定量技術方法是可用的。通常，通過1D/2D十二烷基硫酸鈉(SDS)聚丙烯酰胺凝膠電泳法根據其摩爾質量(MM)和等電點(pI)分離蛋白質，染色；后經凝膠成像定量后，用氣相色譜-質譜法進行定性。在重組蛋白生產過程中，對枯草芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌的蛋白質組進行分析，解決因素，構建工程菌株。在現代蛋白質組學中，人們越來越關注使用非凝膠色譜分離技術和基于質譜(MS)的定量方法，而凝膠電泳主要是作為初步分離步驟，降低蛋白質或多肽的復雜程度更利于分析。

自1919年阿斯頓發明了第一種質譜儀以來，已經取得了大量的進步，并采用了如矩陣輔助激光解吸/電離(MALDI)和電離等軟離子化如噴霧電離(ESI)等方法能測定完整的蛋白質和多肽。然而，對未損壞蛋白質的直接分析仍然具有較大挑戰，測定其組成多肽的仍然是蛋白質分析的有效方法。在芽孢桿菌菌株研究方法中，目前除了蛋白質鑒定之外，對MS蛋白質組學和計算方法的改進已經可以做到相對和絕對定量。

3.3 代謝組學

自基因組、轉錄組和蛋白質組學技術被引入，已被成功地結合起來，得到生物系統功能的新認識。然而，這種組合也迅速顯現其限制性，代謝產物的研究則能彌補基因組與其表型之間的鴻溝。測序的基因組通常包括30%～40%的編碼具有未知功能的蛋白質的基因，或不考慮微小的構型差異可能帶來的潛在生化意義，根據基因相似結構自動歸屬生化功能。而且，雖然代謝物庫在很大程度上取決于酶的濃度和活性，但細胞轉錄體和蛋白質組變異不一定會導致表型改變，說明存在較強的翻譯后調控機制。由于代謝產物進一步連接從基因組到表型和所有合成代謝和分解代謝反應，因此代謝產物很自然地作為下一步研究，以揭示新的基因功能、相互作用、代謝途徑和調節系統。Buescher等系統地分析枯草芽孢桿菌在相應環境變化過程中的代謝產物。

生物體在給定的生理條件下合成的所有代謝物構成其代謝組。對生物體而言，它可包含多達200000種代謝物，其化學性質和濃度(從皮摩爾每升到毫摩爾每升)差異很大。這種多樣性可獲得非常豐富的信息，但同時也使所有代謝物的鑒定和定量，即代謝組學，成為現代生物化學的最大的挑戰之一。代謝物指紋圖譜的目的是對不同的樣品進行分類，而不對代謝物進行定量、鑒別甚至分離，只用它們的特征測量譜作為判別標準。最后，代謝分析旨在對不同的代謝組定性和定量，例如氨基酸、碳水化合物或參與特定途徑的那些代謝物，并理解它的生化作用。

3.4 通量組學

在細胞中，代謝物通過復雜、重疊的途徑不斷轉化為其他代謝產物，最終產生能量和活性物質。基因組、蛋白質組、轉錄組和代謝組之間所有非線性調節和代謝相互作用的最終途徑是通過這些代謝通量(即生化轉化率)之間多樣的調控展現出來的。這些通量均可表征機體的細胞生理方面和可觀測外在的表型。所有的代謝通量都直觀地展現了系統動力學，而其他組學數據則為解釋這些結論提供了必要的基礎。通量組學與其他組學技術的互補，充分顯示了調控機制的復雜性，并表明轉錄后和翻譯后的影響。有趣的是，在最近的研究中，基于轉錄組和代謝組學中的通量數據的實際分布和預測之間存在嚴重差異。通過對枯草芽孢桿菌適應限制營養和滲透變化過程中轉錄組、蛋白質組、代謝組和通量組的分析，提出了一種多功能分析方法，Kohlstedt等在該研究中提供了大量數據，展現了高超的生物技術水平。

代謝通量分析已經是一種成熟的技術，到目前為止，與其他經濟學方法相比，它在研究和工業生產中都被大大低估，無法得到充分利用。它的實際應用范圍只限于驗證引入的遺傳修飾的益處，例如分析突變株或提高重組蛋白在不同芽孢桿菌中的產量。相反，應該將其更廣泛地應用于上游基因設計。應用合理的方法減少硅制品的使用，降低因副產物分泌增加、生長緩慢或細胞死亡等改變而產生的意外和有害的副作用，即所謂的降低了生產力。

在過去的十年里，一些研究進一步證實了通量組學在揭示芽孢桿菌表達系統的非常規優化和克服其限制因素中的極大的潛力。例如，一方面，組學技術應用于增加枯草芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌中蛋白質和維生素的產量；另一方面，最近的一些研究揭示了通量組學在發現新途徑或為已知通路拓展新的生物功能方面的潛力，使之成為發現生物的整體復雜性的不可或缺的工具。

4 前景展望

系統生物學工具在芽孢桿菌基因組、轉錄組、蛋白質組和代謝組中的應用及整體優化是提高重組蛋白產量的有效方法。系統生物學的思想是沿著現有方法，如在芽孢桿菌中構建新的基因，探究其編碼蛋白質及代謝和信號途徑。我們已經進行了第一次嘗試：例如，根據目的蛋白的表達強度，可以從枯草桿菌啟動子庫中選擇合適啟動子；同樣，也可以通過選擇不同的信號肽，調節重組蛋白的分泌途徑和分泌水平。就像啟動子和信號肽序列設計是進一步合成更復雜的DNA結構的第一步，那么將多種芽孢桿菌表達、轉化系統相結合，生產特定蛋白質也是可能的。為了全面優化芽孢桿菌系統，研究表明通過核糖體工程、人工分泌途徑和基因組縮減等方法，能顯著提高重組蛋白的產率。

5 結束語

近年來，芽孢桿菌在生產和分泌重組蛋白方面得到越來越廣泛的應用，主要得益于高效表達系統的快速發展。芽孢桿菌生產的重組藥物產品種類繁多，包括抗體片段、生長因子、干擾素和白細胞介素、胰島素前體、青霉素G酰化酶、鏈霉親和素、葡萄球菌激酶和鏈激酶等。因此，芽孢桿菌逐漸成為重要工業生產用菌。為提高芽孢桿菌生產分泌能力，必須明確其生化過程中調控機制及其主要遺傳特性。因此，應在不同研究水平對芽孢桿菌菌株進行研究，即在不同培養條件下，從基因組學到轉錄組學，從蛋白質組學到代謝組學和通量組學中的不同特征進行探究。為了實現該目標，近期發展起來的系統生物學和組學技術(基因組學、轉錄組學、蛋白質組學、代謝組學和通量組學)成為必不可少的工具。總之，面向系統整體的研究方法才剛剛起步，芽孢桿菌的生產潛力是巨大的，因為組學工具和建模方法已在藥學領域廣泛應用，而應用于芽孢桿菌的實例卻寥寥無幾。未來，為使重組芽孢桿菌更高效地生產藥物，組學技術應更多地用于發現并解決現行生產中的瓶頸，優化工藝達到目標。