小Y染色體對(duì)男性生育力的影響及臨床效應(yīng)分析

張 峰，劉建兵，車(chē)與睿，李天賦，虞 斌

男性不育通常是指夫婦同居1年以上，未采用任何避孕措施，由于男方因素造成女方不孕者[1]。近年來(lái)，不孕不育的發(fā)病率顯著增加，全球約有10%～15%的育齡期夫婦飽受不孕不育的折磨，其中男方因素約占50%[2]，而遺傳學(xué)異常是男性不育的重要原因，約占30%[3]。

人類(lèi)Y染色體是一個(gè)小的近端著絲粒染色體，長(zhǎng)臂大部分是異染色質(zhì)，極易發(fā)生形態(tài)學(xué)變化，導(dǎo)致Y染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)異常。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，長(zhǎng)臂的異染色區(qū)域擴(kuò)大(大Y染色體)/縮小(小Y染色體)是正常變異，沒(méi)有功能或表型效應(yīng)[4]。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，越來(lái)越多的學(xué)者認(rèn)為，大Y染色體具有一定的臨床效應(yīng)，可能會(huì)引起男性少弱畸精癥及配偶自然流產(chǎn)、胚胎停育、死胎等不良孕產(chǎn)史[5-7]，而對(duì)小Y染色體的研究還很少。本研究通過(guò)回顧性分析攜帶小Y染色體患者的臨床效應(yīng)，并進(jìn)行無(wú)精子因子(azoospermia factor,AZF)微缺失檢測(cè)，探討小Y染色體對(duì)男性不育的影響及臨床意義。

1 對(duì)象與方法

1.1對(duì)象 收集2016年7月-2017年7月因不孕不育或配偶有不良孕產(chǎn)史就診的夫婦共1 804對(duì)(實(shí)驗(yàn)組)，分為2組：A組1 269對(duì)，男方年齡(31.00±4.63)歲(23～45歲)，女方年齡(29.85±4.38)歲(21～38歲)，因不孕不育擬行體外授精/卵胞質(zhì)內(nèi)單精子注射-胚胎移植(invitrofertilization/intracytoplasmic sperm injection embryo transfer，IVF/ICSI-ET)；B組535對(duì)，男方年齡(30.52±4.62)歲(23～45歲)，女方年齡(29.53±2.78)歲(21～38歲)，既往有不良孕產(chǎn)史，包括既往自然流產(chǎn)、胎停死胎、復(fù)發(fā)流產(chǎn)、畸形兒生育史等。所有病例均在相應(yīng)的專(zhuān)科門(mén)診就診，經(jīng)詳細(xì)詢(xún)問(wèn)病史及常規(guī)檢查，排除內(nèi)分泌、免疫、感染及外生殖器解剖異常，同時(shí)排除因女方因素導(dǎo)致的不孕不育者。

另選取2014年6月-2017年7月行羊水穿刺且診斷結(jié)果為正常的男性病例656例作為對(duì)照組，年齡(20.85±3.38)歲(23～45歲)，孕婦年齡(29.15±3.28)歲(21～38歲)。羊水穿刺胎兒染色體異常包括胎兒小Y染色體或其他異常。

1.2方法

1.2.1外周血核型檢測(cè) 外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)后，標(biāo)準(zhǔn)G顯帶分析染色體核型。計(jì)數(shù)20個(gè)細(xì)胞中期分裂相，分析5個(gè)核型，異常者加倍計(jì)數(shù)、分析。

1.2.2羊水診斷 孕婦在B超定位下行羊膜腔穿刺，抽取羊水20 mL，按照常規(guī)羊水細(xì)胞培養(yǎng)后，標(biāo)準(zhǔn)G顯帶分析染色體核型，其方法與外周血染色體分析相同。

1.2.3Y染色體AZF微缺失檢測(cè) 使用Y染色體微缺失檢測(cè)試劑盒(PG07001Y4，上海透景生命科技股份有限公司)檢測(cè)AZF的6個(gè)標(biāo)簽位點(diǎn)(sequence-tagged site，STS)。每個(gè)樣本做A組、B組2個(gè)多重PCR反應(yīng)，A組包括sY84，sY127，sY255 3個(gè)位點(diǎn)，B組包括sY86，sY134，sY254 3個(gè)位點(diǎn)。每組設(shè)置一對(duì)Y染色體性別決定基因(sex-determinning region of the Y chromosome,SRY)的引物作為內(nèi)對(duì)照。應(yīng)用PCR儀(ABI7500，美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)擴(kuò)增DNA，收集信號(hào)并通過(guò)擴(kuò)增曲線直接觀察結(jié)果。

1.2.4相關(guān)標(biāo)準(zhǔn) (1)小Y染色體是指Y染色體長(zhǎng)度≤21號(hào)染色體；(2)參照文獻(xiàn)[8]的方法，采用計(jì)算機(jī)輔助精子分析技術(shù)(computer-aided sperm analysis,CASA)檢測(cè)男性精液，若精子密度<15×106mL-1或每次射精精子總數(shù)<39×106，稱(chēng)為少精子癥；若精液參數(shù)指標(biāo)中前向運(yùn)動(dòng)的精子(progressive motility,PR)<32%稱(chēng)為弱精子癥；3次檢查精子密度且精液離心涂片后也未能發(fā)現(xiàn)精子，則診斷為無(wú)精子癥；形態(tài)正常的精子<40%診斷為畸形精子癥；(3)復(fù)發(fā)性流產(chǎn)指流產(chǎn)≥2次；遺傳缺陷生育史需出生醫(yī)學(xué)證明佐證；(4)PCR結(jié)果：每個(gè)位點(diǎn)結(jié)果為典型的S曲線且Ct<32，表示該區(qū)域序列存在，反之表示缺失。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，不同組間的小Y檢出率的差別采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1小Y染色體檢出率比較 1 804例男性患者中，共檢出小Y染色體44例(2.44%)，A組及B組分別檢出31及13例[已剔除1例，該例患者的配偶染色體核型表現(xiàn)異常，為46,XX,t(4;6)(q21;p21.1)，臨床效應(yīng)為自然流產(chǎn)2次]。對(duì)照組656例中，共檢出小Y染色體6例(0.91%)。A組與B組比較，差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.000 1，P=0.992)；A組及B組分別與對(duì)照組比較，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2小Y染色體的臨床效應(yīng)分析及比較 44例小Y染色體的臨床效應(yīng)表現(xiàn)為無(wú)精癥3例、少弱畸精癥28例、配偶胚胎停育2例、自然流產(chǎn)9例、羊水穿刺診斷為小Y染色體及21三體各1例(基于配偶的染色體核型分析正常及排除其他器質(zhì)性病因)。

2.3AZF微缺失檢測(cè)分析 A組的小Y染色體患者中，AZF微缺失3例，其中2例為AZFc缺失，臨床表現(xiàn)為嚴(yán)重少精癥，1例為AZFb+c缺失，臨床表現(xiàn)為無(wú)精癥，占所有小Y檢出者的6.81%。B組的小Y染色體患者未檢出AZF缺失(圖1)。

A，B：正常男性(sY84,sY86,sY127,sY134,sY255,sY254均存在)；C，D：AZFc(sY255,sY2547)微缺失患者；E，F(xiàn)：AZFb+c(sY127,sY134,sY255,sY254)復(fù)合缺失患者.圖1 AZF微缺失檢測(cè)結(jié)果Fig 1 The results of men with AZF deletion

3 討 論

目前，不孕不育的問(wèn)題日益嚴(yán)重，染色體異常是不孕不育的重要因素之一，包括克氏綜合征、染色體畸變及染色體多態(tài)性等。Y染色體多態(tài)性是臨床常見(jiàn)的染色體多態(tài)性之一，主要表現(xiàn)為長(zhǎng)臂的長(zhǎng)度變異。本研究通過(guò)分析小Y染色體的臨床效應(yīng)，結(jié)合Y染色體微缺失檢測(cè)，探討小Y染色體與男性生育能力的關(guān)系。

本研究1 804例就診的男性患者中，共檢出小Y染色體44例，其中A組31例，B組13例(已剔除1例)，檢出率2.44%。A組31例小Y染色體患者均存在不同程度的生精異常，表現(xiàn)為少精、弱精、畸精、無(wú)精等，提示小Y染色體可能對(duì)男性生育能力有潛在的臨床效應(yīng)。探討其發(fā)病機(jī)制，可能是小Y染色體的異染色質(zhì)部分或者完全丟失，引起常染色質(zhì)排列疏松，造成基因功能喪失和精子生成異常，或是小Y染色體染色質(zhì)排列過(guò)度緊密影響其功能的發(fā)揮[9-10]。Y染色體的長(zhǎng)臂Yq11常染色質(zhì)區(qū)存在與精子發(fā)生相關(guān)的基因，稱(chēng)為AZF[11]。Y染色體上不同區(qū)AZF缺失可導(dǎo)致不同的精子發(fā)生障礙，臨床上可表現(xiàn)為男性無(wú)精子癥或嚴(yán)重少精子癥[12]。研究發(fā)現(xiàn)，Y染色體基因微缺失是男性不育的重要原因[13]。A組小Y染色體患者中，AZFc缺失2例，AZFb+c復(fù)合缺失1例，臨床表現(xiàn)分別為嚴(yán)重少精子癥及無(wú)精癥；余28例主要表現(xiàn)為少精、弱精、畸精、無(wú)精癥，但不存在AZF相關(guān)基因的缺失。由此推斷，單純小Y染色體就可能對(duì)男性生精造成影響，若小Y染色體合并AZF相關(guān)區(qū)域缺失，可導(dǎo)致Y染色體上的Yq11常染色質(zhì)與Yq12異染色質(zhì)共同缺失，更容易導(dǎo)致男性不育癥。

廣義的男性不育還包括夫妻雖然能夠妊娠，但不能正常維持整個(gè)妊娠過(guò)程并分娩健康活嬰，導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局[14]。本研究結(jié)果亦顯示，A組與B組中的小Y檢出率差別并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示小Y的臨床效應(yīng)可能不僅表現(xiàn)為男性生精功能障礙，還可能表現(xiàn)在配偶的不良妊娠結(jié)局上，如胎停、自然流產(chǎn)及其他不良妊娠結(jié)局。本研究B組檢出的14例小Y染色體患者中，有1例配偶染色體核型異常[46,XX,t(4;6)(q21;p21.1)]，剔除該例，基本排除配偶在生殖方面的影響。余13例表現(xiàn)出的臨床效應(yīng)：7例配偶有流產(chǎn)史(流產(chǎn)1次1例，≥2次6例)；2例配偶有稽留流產(chǎn)史；1例配偶有21-三體生育史；1例羊水穿刺提示為小Y染色體。B組均未發(fā)現(xiàn)AZF缺失，說(shuō)明這些小Y染色體的長(zhǎng)度變異可能只是DNA鏈螺旋化程度的改變而造成的，并未涉及影響精子發(fā)生的基因。因此，推斷可能還有其他原因?qū)е逻@些患者的不良妊娠結(jié)局[10]。

本研究的局限是缺乏正常人群作對(duì)照，原因是正常生育的夫婦很少會(huì)到門(mén)診來(lái)檢查。因此本課題選用了行羊水診斷結(jié)果為正常的男性作為近似對(duì)照組。綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)小Y染色體與男性生精異常及配偶不良妊娠結(jié)局存在一定的關(guān)系，小Y染色體合并AZF相關(guān)區(qū)域缺失更容易導(dǎo)致男性不育。在后續(xù)的研究中，本課題組擬采用染色體外顯子檢測(cè)技術(shù)，篩選與小Y染色體相關(guān)的拷貝數(shù)變異(copy number variations，CNV)，精選關(guān)鍵的CNV，探討其發(fā)生率與致病性，進(jìn)一步從分子水平揭示小Y染色體與男性生育力影響的關(guān)系。