河南漢族人口F11基因rs2036914 T/C多態性與靜脈血栓栓塞癥的相關性

謝明紅，郭亞麗，祁亞楠，李亞萍，陳 丹，吳紀珍，齊 詠

(1.河南省人民醫院呼吸與危重癥醫學科，河南 鄭州 450000；2.河南省人民醫院老年醫學科，河南 鄭州 450000)

靜脈血栓栓塞癥(venous thromboembolism，VTE)包括肺栓塞(pulmonary embolism，PE)和深靜脈血栓形成(deep venous thrombosis，DVT)。造成VTE的因素包括內皮損傷或活化、血流減少和血液高凝狀態，即Virchow三聯征。VTE是一種具有高遺傳性的復雜疾病，研究顯示，50%以上VTE患者與遺傳學危險因素有關[1]。F11基因[2-6]位于4q35.2位點上，編碼凝血因子XI，其多態性與VTE密切相關[4，7]。最近研究顯示，F11基因rs2036914 T/C多態性與VTE的發生密切相關，但研究人群多來源于國外，種族多為高加索人、非洲人等[ 4,8-11]。但是目前關于中國人的F11基因rs2036914 T/C多態性與VTE的研究，國內尚未見報道。本研究采用PSTAR高通量位點測序技術研究F11的rs2036914 T/C位點多態性，并分析其與河南省漢族人口VTE的關系，為基因治療的機制方面提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2016年3月至2017年3月在河南省人民醫院住院治療的VTE患者82例為病例組，其中男46例，女36例，年齡21～89(60.00±16.22)歲，繼發性VTE 63例(繼發組)，其中PE 18例，DVT 55例。另選擇性別、年齡匹配的正常志愿者82例作為對照組，男46例，女36例，年齡18～89(60.00±16.73)歲。本研究通過醫院倫理委員會審核批準。病例組和對照組患者性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2 納入標準和排除標準納入標準：(1)年齡18～89歲；(2)DVT診斷符合中華醫學會外科學分會血管外科學組制定的DVT診斷和治療指南中的診斷標準[12]；(3)PE的診斷符合中華醫學會呼吸病學分會肺栓塞與肺血管病學組制定的肺血栓栓塞癥診治與預防指南中的診斷標準[13]；(4)臨床資料完整；(5)患者及家屬對本研究知情同意。排除標準：惡性腫瘤、自身免疫性疾病、血液系統疾病及已經使用溶栓、抗凝藥物的患者。

1.3 主要試劑與儀器血液基因組DNA提取試劑盒、測序反應通用試劑盒購自武漢康昕瑞基因健康科技有限公司，100 bp DNA Ladder購自Takara寶生物工程(大連)有限公司，所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成。基因測序儀購自深圳華因康基因科技有限公司、聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)儀購自德國艾本德公司，-80 ℃冰箱購自青島海爾股份有限公司，渦旋震蕩儀購自海門其林貝爾儀器制造有限公司，NanoDrop超微量分光光度計購自美國賽默飛公司，凝膠成像儀購自上海天能科技有限公司，電泳儀、垂直電泳槽購自上海天能科技有限公司，水平電泳槽購自北京市六一儀器廠。

1.4 方法

1.4.1 靜脈血采集病例組患者入院確診VTE后，在應用抗凝藥物治療前采集空腹外周靜脈血，對照組受試者采集清晨空腹外周靜脈血，儲存于-80 ℃冰箱。

1.4.2 全血DNA的提取和多態位點檢測區域序列的獲取采用DNA提取試劑盒，按照操作步驟提取全血DNA 2 μg。應用Primer premier 5引物設計軟件在多態性位點附近100 bp左右區域設計引物，引物序列在國家生物技術信息中心數據庫中進行比對，確定引物特異性，上游引物序列：5′-CAGAAGGCTCGTTCCAGACC-3′，下游引物序列：5′-TTGTCTTGGAGACAAGGAGTGC-3′，PCR反應體系共25 μL，PCR反應程序為94 ℃ 4 min；94 ℃ 20 s，57 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，20個循環；72 ℃ 3 min；10 ℃保存。目的片斷連接磁珠，對連接目的片斷的磁珠進行回收混合。

1.4.3 高通量測序開啟測序儀，使用PStar軟件中初始化操作模塊，點擊初始化(I)；將反應小室上的進液口與測序儀XY平臺一端與泵相連的軟管相連，將反應小室上的出液口與廢液瓶上軟管相連；使用PStar軟件，從裝有Buffer離心管中吸取溶液，用于測序；在PStar主控界面中點擊“檢測(T)”，進入“硬件檢測(H)”模塊。將試劑盒中10×Seq Buffer B、10×Seq Buffer C、10×Seq Buffer W用ddH2O稀釋10倍，配制成 1×Seq Buffer B、1×Seq Buffer C、1×Seq Buffer W后放在測序儀的Work Station B區位置上；加入上述組分后混勻，3 000 r·min-1離心30 s，放入測序儀相應試劑區域。在PStar 主控界面中依次點擊設置，進行試劑參數設置；在PStar主控界面中點擊“Run”Custom功能模塊，點擊Start，運行測序程序。

1.5 統計學處理應用SPSS 22.0軟件進行統計分析。2組受試者基因型和等位基因頻率的比較采用χ2檢驗。應用logistic回歸模型分析F11基因rs2036914 T/C多態性與VTE的相關性。從logistic回歸模型中得到優勢比(odds ratio,OR)和95%可信區間(confidence interval，CI)。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病例組和對照組受試者F11基因rs2036914基因型和等位基因頻率比較結果見表1。對照組和病例組受試者基因型分布均符合Handy-Weinberg平衡(P>0.05)。病例組患者等位基因C頻率高于對照組，差異有統計學意義(OR=2.192，95%CI：下限為1.298、上限為3.703,P<0.05)。

表1 病例組和對照組受試者 F11基因rs2036914 基因型和等位基因頻率比較

注：與對照組比較aP<0.05。

2.2 病例組和對照組受試者F11基因rs2036914位點遺傳模型的分析結果見表2。病例組患者隱性遺傳模型(CC比CT+TT)中CC基因型頻率高于對照組(OR= 3.219，95%CI：下限為1.690、上限為6.126，P<0.01)；病例組隱性遺傳模型(CC+CT比TT)中TT+CT基因型頻率與對照組比較差異無統計學意義(OR=1.000，95%CI：下限為0.196、上限為5.106，P>0.05)。

表2 病例組和對照組受試者F11基因rs2036914位點遺傳模型的分析

注：與對照組比較aP<0.05。

2.3 繼發組和對照組受試者F11基因rs2036914 T/C多態性比較結果見表3。繼發組患者C等位基因頻率明顯高于對照組，差異有統計學意義(OR=2.392，95%CI下限為1.338、上限為4.277，P<0.05)。

表3 繼發組和對照組受試者F11基因rs2036914 T/C多態性比較

注：與對照組比較aP<0.05。

3 討論

VTE是凝血因子、凝血蛋白和纖溶蛋白等多種因素參與的一類機制復雜的疾病，遺傳因素和獲得性因素共同作用導致VTE的發生。目前，已發現遺傳性易栓癥存在多種基因缺陷種類，但具有種族和地域性差異[14]。2011年我國一項22省市60多家三甲醫院參與的研究顯示，近15年來住院患者PE發病率逐年上升，已達1%，該水平已與白種人群VTE發病率持平[15]。然而，關于中國人群患VTE的遺傳方面的研究甚少。

凝血因子XI是一種血漿絲氨酸蛋白酶原，在體內和體外的凝血途徑中都起著重要作用，在血漿止血的起始和擴增階段起著橋梁作用。研究發現，F11基因敲除小鼠的血栓形成率降低[5]。凝血因子XI水平升高與血栓形成有關[7]。LI等[9]研究發現，F11基因rs2036914多態性是VTE的獨立危險因素。Meta分析顯示，F11基因rs2036914多態性與VTE顯著相關[16]，其研究的人群來源于國外，但目前關于中國人F11基因rs2036914多態性與VTE的關系尚未見報道。

本研究納入者均為河南省漢族VTE患者，應用PSTAR高通量位點測序技術初步探討凝血因子F11基因rs2036914 T/C多態性與VTE的相關性，結果顯示，等位基因C為風險基因，其攜帶者發生VTE風險會增加，結合繼發組的分析結果，提示攜帶等位基因C的患者更具易感性，與以往的研究結果一致[16-17]。本研究結果顯示，病例組患者隱性遺傳模型中CC基因型頻率高于對照組，其95%CI下限大于1，提示基因型CC可能為VTE的遺傳危險因素，該結果與文獻報道[16]相符。但本研究為單中心小樣本研究，未進一步檢測血樣本中凝血因子XI的水平及活化水平。F11基因多態性與中國人群患VTE的相關性有待進一步的研究。

綜上所述，F11基因rs2036914 T/C多態性可能是河南省漢族人口發生VTE的遺傳危險因素，在外傷或手術的影響下，攜帶等位基因C人群罹患VTE的風險更高。