不同劑量米非司酮對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥大鼠異位內(nèi)膜組織中環(huán)氧合酶-2和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的影響

南 燕，侯妍妍，李玉潔

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南 新鄉(xiāng) 453003)

子宮內(nèi)膜異位癥是生育期女性常見(jiàn)的婦科疾病，生育年齡大、生育次數(shù)少者多發(fā)，絕經(jīng)后使用激素替代治療者也有發(fā)病，患者多以慢性盆腔痛、性交痛、不孕、月經(jīng)失調(diào)等為主要臨床表現(xiàn)[1]，給生育期女性帶來(lái)了嚴(yán)重困擾。子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能與基因、新生血管形成、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、免疫和子宮收縮異常等有關(guān)[2]。目前，臨床醫(yī)生多主張盡量給予藥物治療，但臨床上治療子宮內(nèi)膜異位癥的藥物繁多，只有徹底明確藥物的作用機(jī)制，才能保障用藥安全性和合理性。本研究選取造模成功的子宮內(nèi)膜異位癥大鼠作為研究對(duì)象，觀察不同劑量米非司酮對(duì)子宮內(nèi)膜異位病灶及異位病灶中環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取8周齡健康清潔級(jí)雌性Sprague Dawley大鼠120只，體質(zhì)量200～220 g，由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，確認(rèn)均為發(fā)情期的性成熟大鼠。

1.2 藥物、試劑與儀器米非司酮藥粉劑(上海麥克林生化科技有限公司)，放射免疫沉淀(radioimmunoprecipitation assay,RIPA)裂解液、 二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒(北京鼎國(guó)昌盛生物有限責(zé)任公司)；組織切片機(jī)(浙江金華市科迪儀器有限公司)，JY92-II超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(上海新芝生物技術(shù)研究所)，DG-300C電泳儀(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)。

1.3 子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠制備及分組SD大鼠采用100 g·L-1水合氯醛腹腔麻醉后在尿道口上方腹部做切口，切取部分子宮，置于生理鹽水中，將子宮內(nèi)膜與肌層分離后，取5 mm×4 mm的內(nèi)膜組織將其縫于切口邊緣內(nèi)側(cè)血管豐富的腹壁上，4周后再次開(kāi)腹，在腹壁下發(fā)現(xiàn)顏色異常的漿液性水皰或質(zhì)硬團(tuán)塊組織，并經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí)為存活的異位內(nèi)膜組織，說(shuō)明建模成功。選取112只建模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組及低、中、高劑量米非司酮組，每組28只。模型組大鼠給予1 mL花生油灌胃，每日1次，共4周；低、中、高劑量米非司酮組大鼠分別按1.04、1.24 2.60 mg·kg-1給予米非司酮混懸液灌胃，每日1次，共4周。低、中、高劑量對(duì)應(yīng)臨床用藥分別為10.0、12.5、25.0 mg·d-1，根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)藥物計(jì)算公式換算得出低、中、高劑量米非司酮組大鼠用藥劑量分別為1.04、1.24、2.60 mg·kg-1。米非司酮混懸液由米非司酮原藥粉加入花生油中形成，質(zhì)量濃度為1 g·L-1。

1.4 各組大鼠異位內(nèi)膜組織體積測(cè)量模型建立成功后，麻醉大鼠開(kāi)腹測(cè)量大鼠異位內(nèi)膜組織長(zhǎng)、寬、高，根據(jù)體積=0.52×長(zhǎng)(mm)×寬(mm)×高(mm)[3]，計(jì)算異位內(nèi)膜組織體積。灌胃治療 4 周后，再次剖腹測(cè)量并計(jì)算異位病灶體積，同時(shí)取異位病灶組織，于-80 ℃凍存待用。

1.5 Western blot檢測(cè)大鼠異位內(nèi)膜組織中 COX-2和VEGF蛋白表達(dá)將米非司酮干預(yù)后所取異位內(nèi)膜組織碎塊于冰塊上粉碎，加入細(xì)胞組織快速裂解液及苯甲基磺酰氟，裂解粉碎，4 ℃下12 000 r·min-1離心10 min，提取組織蛋白，以二喹啉甲酸法進(jìn)行蛋白定量，制膠，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，逐步加入一抗、二抗孵育后曝光鑒定，對(duì)膠片進(jìn)行掃描，結(jié)果采用Quantity One分析軟件進(jìn)行分析，以β-actin 為內(nèi)參，計(jì)算COX-2、VEGF蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠異位內(nèi)膜組織體積比較結(jié)果見(jiàn)表1。模型組大鼠治療后異位內(nèi)膜組織體積與治療前比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；低、中、高劑量米非司酮組大鼠治療后異位內(nèi)膜組織體積均小于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。治療前各組大鼠異位內(nèi)膜組織體積比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；治療后，低、中、高劑量米非司酮組大鼠異位內(nèi)膜組織體積均小于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中、高劑量米非司酮組大鼠異位內(nèi)膜組織體積小于低劑量米非司酮組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高劑量米非司酮組大鼠異位內(nèi)膜組織體積小于中劑量米非司酮組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 4組大鼠異位內(nèi)膜組織體積比較

注：與模型組比較aP<0.05；與低劑量米非司酮組比較bP<0.05；與中劑量米非司酮組比較cP<0.05。

2.2 4組大鼠異位內(nèi)膜組織中COX-2、VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量比較結(jié)果見(jiàn)表2和圖1。治療前各組大鼠異位內(nèi)膜組織中COX-2、VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。模型組大鼠治療后異位內(nèi)膜組織中COX-2、VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量與治療前比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；低、中、高劑量米非司酮組大鼠治療后異位內(nèi)膜組織中 COX-2、VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。低、中、高劑量米非司酮組大鼠異位內(nèi)膜組織中COX-2、VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中、高劑量米非司酮組大鼠異位內(nèi)膜組織中COX-2、VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量低于低劑量米非司酮組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；高劑量米非司酮組大鼠異位內(nèi)膜組織中COX-2、VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量低于中劑量米非司酮組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2 4組大鼠異位內(nèi)膜組織中COX-2、VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量

nCOX-2VEGF28 0.610±0.012 0.618±0.023 0.608±0.0330.610±0.03128 0.613±0.0460.604±0.041 0.487±0.030ab0.485±0.028ab28 0.606±0.0320.624±0.036 0.427±0.027abc0.420±0.024abc28 0.609±0.0360.615±0.086 0.384±0.020abcd0.356±0.023abcd

注：與治療前比較aP<0.05;與模型組比較bP<0.05;與低劑量組比較cP<0.05；與中劑量組比較dP<0.05。

A:模型組；B：低劑量米非司酮組；C：中劑量米非司酮組；D：高劑量米非司酮組。

圖1 4組大鼠異位內(nèi)膜組織中COX-2、VEGF蛋白表達(dá)(Western blot)

Fig.1 Expression of COX-2 and VEGF protein in endometriotic tissues of rats among the four groups(Western blot)

2.3 各組大鼠異位內(nèi)膜組織中COX-2與VEGF蛋白表達(dá)的相關(guān)性Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，異位內(nèi)膜組織中COX-2與VEGF蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.782，P<0.05)。

3 討論

米非司酮用于治療子宮內(nèi)膜異位癥已有20多年，其能改善患者盆腔疼痛，并使異位病灶萎縮。LI等[4]研究證實(shí)，米非司酮可降低子宮內(nèi)膜異位癥大鼠異位內(nèi)膜組織中COX-2基因轉(zhuǎn)錄，從而降低前列腺素分泌。徐妍等[5]研究顯示，米非司酮可抑制子宮內(nèi)膜異位癥大鼠異位內(nèi)膜組織內(nèi)炎性因子、侵襲基因、凋亡抑制基因的表達(dá)，同時(shí)增加促凋亡基因的表達(dá)。臨床上將米非司酮單獨(dú)或聯(lián)合其他藥物用于治療子宮內(nèi)膜異位癥，但是關(guān)于劑量的選擇目前尚無(wú)統(tǒng)一定論，臨床用藥劑量為5～25 mg，均無(wú)明確標(biāo)準(zhǔn)說(shuō)明治療的最佳劑量。張曉平[6]認(rèn)為，腹腔鏡手術(shù)聯(lián)合米非司酮治療子宮內(nèi)膜異位癥的療效較理想，且安全性高。馮珀霖等[7]研究顯示，醋酸曲普瑞林治療子宮內(nèi)膜異位癥的作用優(yōu)于米非司酮，其能夠降低復(fù)發(fā)率，但是潮熱、圍絕經(jīng)期癥狀、胃腸道反應(yīng)等不良反應(yīng)明顯多于米非司酮，臨床長(zhǎng)期用藥應(yīng)慎重考慮。還有學(xué)者采用米非司酮聯(lián)合孕三烯酮[8]、米非司酮聯(lián)合中藥[9-12]等方案治療了宮內(nèi)膜異位癥，結(jié)果顯示，這些治療方案均能有效改善患者癥狀，減輕盆腔疼痛，降低術(shù)后復(fù)發(fā)率，且不良反應(yīng)輕。

COX-2是一種膜結(jié)構(gòu)蛋白，能將花生四烯酸代謝為各種前列腺素產(chǎn)物，可被多種生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、脂多糖、腫瘤啟動(dòng)因子等誘導(dǎo)產(chǎn)生。VEGF與多種腫瘤及炎癥疾病的發(fā)生有關(guān)，VEGF在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生中參與新生血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)新生血管形成[13-14]，與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病、進(jìn)展有關(guān)。秦江霞等[15]研究顯示，COX-2、VEGF在子宮內(nèi)膜異位癥患者異位內(nèi)膜組織中高表達(dá)，與子宮內(nèi)膜異位血管的生成有關(guān)。JANA等[16]研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)金屬蛋白酶-2可通過(guò)環(huán)氧化酶2-前列腺素E2-磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶途徑參與血管細(xì)胞遷移和侵入，在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病中起著重要作用。

本研究結(jié)果顯示，米非司酮治療后，大鼠體內(nèi)異位內(nèi)膜組織體積較治療前明顯減小，異位子宮內(nèi)膜組織中COX-2、VEGF蛋白表達(dá)明顯降低；且給藥劑量越高，上述各指標(biāo)下降越明顯。本研究還發(fā)現(xiàn)，異位子宮內(nèi)膜組織中COX-2、VEGF蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。米非司酮可能通過(guò)抑制雌激素和炎性因子的產(chǎn)生減少COX-2生成，阻止異位內(nèi)膜組織中新生血管生成來(lái)抑制疾病進(jìn)展。有研究發(fā)現(xiàn)，低劑量米非司酮(6.25 mg)與高劑量米非司酮(12.50 mg) 治療子宮內(nèi)膜異位癥的效果相當(dāng)，但服用小劑量米非司酮患者發(fā)生惡心、嘔吐、頭暈、皮疹等不良反應(yīng)者較少[17-18]。陳勇[19]采用不同劑量米非司酮治療腹腔鏡下子宮內(nèi)膜異位癥患者病灶清除后的患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小劑量米非司酮組(6.3 mg)患者的癥狀緩解率和復(fù)發(fā)率均優(yōu)于大劑量米非司酮組(12.5 mg)，且對(duì)患者體內(nèi)激素水平的影響小于大劑量米非司酮組。楊其偉[20]也探討了不同劑量米非司酮治療子宮內(nèi)膜異位癥的臨床療效，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同劑量米非司酮對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥患者均有較好療效，但低劑量米非司酮對(duì)患者內(nèi)分泌水平影響更小，長(zhǎng)期應(yīng)用不影響患者骨密度。

總之，本研究結(jié)果顯示，高劑量米非司酮治療子宮內(nèi)膜異位癥可取得更好的療效，但其是否會(huì)帶來(lái)相關(guān)不良反應(yīng)尚需進(jìn)一步研究。