芒柄花黃素對人增生性瘢痕成纖維細胞生長的作用

回 薔，林時秀，郭冰玉，常 鵬，徐志山，陶 凱

0 引言

增生性瘢痕通常繼發于燒傷、創傷及手術后，表現為局部組織僵硬、發紅、瘙癢和隆起于皮膚表面，好發于頦部、耳部、雙上臂及胸前區等部位，嚴重時可發生攣縮，造成關節畸形和器官移位，不僅影響美觀，還會給患者的日常生活帶來困擾[1]。成纖維細胞過度增殖、以膠原為主的細胞外基質成分異常沉積是增生性瘢痕形成的機制之一，因此，對成纖維細胞作用的研究成為治療增生性瘢痕的關鍵[2]。

芒柄花黃素又名刺芒柄花素、芒柄花素，是從豆科植物紅車軸草的花序及帶花枝葉或刺芒柄花全草中提取的異黃酮類成分之一。越來越多的研究表明，芒柄花黃素具有抗氧化、抗腫瘤和抗炎等多種藥理作用[3]。有文獻報道，芒柄花黃素能夠抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡[4]，因此，推斷芒柄花黃素對增生性瘢痕也具有一定的治療作用。

本研究初步探討了芒柄花黃素對人增生性瘢痕成纖維細胞增殖與凋亡的作用，并對細胞周期蛋白與抗凋亡蛋白的變化進行了分析，旨在為增生性瘢痕的預防與臨床治療奠定理論基礎。

1 材料與方法

DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶(北京索萊寶科技有限公司)，Annexin V-FITC、PI、NP-40裂解液(上海碧云天生物技術有限公司)，二甲基亞砜(國藥集團化學試劑有限公司)，芒柄花黃素(美國Selleck生物科技有限公司)，細胞周期檢測試劑、總RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、SYBR試劑盒(寶生物工程大連有限公司)，Cyclin D1抗體、Bcl-2抗體和GAPDH抗體(艾博抗上海貿易有限公司)。

2 方法

2.1 細胞提取與培養 隨機選取2017年3-8月于我院整形外科就診的8位患者，手術切除創傷愈合后的增生性瘢痕組織，留取局部皮瓣轉移修復后剩余的正常皮膚，提取成纖維細胞后進行培養。將切取的新鮮增生性瘢痕組織與正常皮膚的真皮層置于5 ml 0.25%的胰蛋白酶溶液中，4 ℃冷消化過夜。加入適量含10%胎牛血清的DMEM，置于37 ℃ 5% CO2飽和濕度的孵箱中進行培養。

2.2 MTT試驗 選取對數生長期的成纖維細胞，胰蛋白酶消化后進行離心，重新制成單細胞懸液。以1×103/孔的密度將成纖維細胞接種于96孔板中，12 h后加入二甲基亞砜(DMSO)、10 μmol/L和20 μmol/L的芒柄花黃素處理細胞，每組3個復孔。避光條件下，分別于第0、12、24、36、48小時在每孔中加入5 mg/ml的MTT，37 ℃孵箱中孵育4 h。用1 ml無菌注射器吸去上清液，分別加入100 μl DMSO溶解形成的MTT-甲臜結晶，使用酶標儀測量490 nm處的吸光值。

2.3 流式細胞檢測 以1×106/L的濃度將細胞接種于6孔板中，待細胞貼壁后分別加入DMSO，10、20 μmol/L的芒柄花黃素處理細胞24 h。胰蛋白酶消化后制成單細胞懸液，加入預冷的70%乙醇固定過夜。以800 r/min的速度離心5 min，棄上清，PBS洗滌細胞。在每管細胞中加入500 μl染色緩沖液，充分緩慢混勻，制成單細胞懸液。加入25 μl碘化丙啶(PI)染色液并充分混勻，再加入10 μl Rnase，37 ℃條件下避光染色30 min，進行流式檢測。

2.4 AV-PI染色 分別以DMSO及10、20 μmol/L的芒柄花黃素處理細胞24 h，胰蛋白酶消化后離心5 min，收集下層的細胞沉淀，PBS洗滌后制成單細胞懸液。在每管細胞中加入500 μl的Binding Buffer進行重懸，依次加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI。輕輕混勻細胞，室溫下避光孵育15 min，流式細胞儀進行分析。

2.5 Hoechest 33258染色 分別用DMSO及10、20 μmol/L的芒柄花黃素處理細胞24 h，依次在每孔中加入100 μl Hoechest 33258染色液，室溫條件下孵育15 min，熒光顯微鏡下觀察細胞的染色情況。

2.6 Western blot試驗 以DMSO及10、20 μmol/L的芒柄花黃素處理細胞24 h，NP-40裂解液裂解細胞，制備細胞裂解液。分別取30 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳，電轉移至PVDF膜后置于5%的脫脂奶粉中，室溫封閉1 h。加入一抗Cyclin D1、Bcl-2和GAPDH，4 ℃條件下孵育過夜。洗膜，加入二抗室溫孵育1 h。采用ECL發光法檢測蛋白的表達情況。

2.7 RT-PCR試驗 應用DMSO及10、20 μmol/L的芒柄花黃素處理細胞24 h，按照試劑盒說明書的操作步驟提取細胞總RNA，反轉錄成cDNA后進行RT-PCR反應，共進行40個循環。計算相對于GAPDH水平的基因表達水平，合成的引物序列為Cyclin D1,F(5′-3′):CCGAGGAGCTGCTGCAAATGGAGC，R(5′-3′):TGAAATCGTGCGGGGTCATTGCGGC;Bcl-2,F(5′-3′):GGTGAACTGGGGGAGGATTG，R(5′-3′) GGCAGGCATGTTGACTTCAC;GAPDH,F(5′-3′):AGAAGGCTGGGGCTCATTTG，R(5′-3′):AGGGGCCATCCACAGTCTTC。

3 結果

3.1 不同濃度芒柄花黃素對正常皮膚與增生性瘢痕成纖維細胞的作用 分別加入10、20 μmol/L的芒柄花黃素處理24 h，其對正常皮膚組織成纖維細胞的增殖影響較小，與對照組比較，差異無統計學意義，見圖1A。而增生性瘢痕成纖維細胞的增殖均受到明顯抑制，且藥物濃度越高、作用時間越長，抑制作用越明顯，與對照組比較，差異有統計學意義，見圖1B。

3.2 不同濃度芒柄花黃素對人增生性瘢痕成纖維細胞周期的影響 通過流式細胞技術檢測發現，經芒柄花黃素處理的成纖維細胞大部分阻滯于G1期，進入S期的細胞減少，細胞周期的進程受到阻斷。細胞增殖受抑制程度與藥物的濃度呈正比，與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

3.3 不同濃度芒柄花黃素對人增生性瘢痕成纖維細胞凋亡的影響 Annexin V-FITC/PI雙染色法顯示，芒柄花黃素作用后，成纖維細胞的早期凋亡率有所增加，并且隨著藥物濃度的遞增，促凋亡作用愈加明顯(P<0.05)，見表1。在熒光顯微鏡下觀察Hoechest 33258染色后的細胞凋亡情況，與對照組比較，經芒柄花黃素處理的成纖維細胞凋亡率有所增加，當濃度為20 μmol/L時，細胞凋亡最顯著，見圖3。

圖1 不同濃度芒柄花黃素對正常皮膚(A)與增生性瘢痕(B)成纖維細胞的作用

圖2 不同濃度芒柄花黃素對成纖維細胞周期的影響

表1 不同濃度芒柄花黃素對成纖維細胞凋亡的影響

注：UL：壞死細胞，UR：晚期凋亡，LL：正常細胞，LR：早期凋亡。*與DMSO組比較，P<0.05；#與10 μmol/L組比較，P<0.05

圖3 不同濃度芒柄花黃素對成纖維細胞凋亡的影響

3.4 芒柄花黃素對成纖維細胞增殖相關蛋白的影響 芒柄花黃素對Cyclin D1具有一定程度的抑制作用，且藥物濃度越高，抑制作用越強，見圖4。RT-PCR實驗結果顯示，與對照組比較，芒柄花黃素能夠在RNA水平上下調Cyclin D1的表達，隨著藥物濃度的升高，Cyclin D1 mRNA的表達水平逐漸下降，見圖5。

圖4 芒柄花黃素對成纖維細胞Cyclin D1的影響

圖5 芒柄花黃素對成纖維細胞Cyclin D1 mRNA表達的影響

3.5 芒柄花黃素對成纖維細胞凋亡相關蛋白的影響 通過Western blot和RT-PCR實驗發現，與對照組比較，不同濃度的芒柄花黃素對細胞凋亡相關蛋白Bcl-2均有影響，能夠有效抑制凋亡相關蛋白Bcl-2的表達。處理細胞的藥物濃度越高，其對Bcl-2的抑制作用越明顯(P<0.05)，見圖6、圖7。

圖6 芒柄花黃素對成纖維細胞Bcl-2的影響

4 討論

增生性瘢痕是成纖維細胞對組織損傷應答而形成的細胞外基質過量沉積的一種纖維化疾病，主要特征是真皮層成纖維細胞過度增殖與活化、細胞外基質蛋白代謝紊亂[5]。增生性瘢痕突出于皮膚表面，形狀不規則、質韌，伴有瘙癢感甚至灼痛感，對患者的外觀和骨骼肌功能造成了不利影響[6]。成纖維細胞是增生性瘢痕形成的重要效應細胞之一，因此，抑制成纖維細胞的增殖、促進其凋亡是治療增生性瘢痕的關鍵。

圖7 芒柄花黃素對成纖維細胞Bcl-2 mRNA表達的影響

芒柄花黃素是一種具有生物活性的非甾體多酚，廣泛存在于多種植物中，具有類雌二醇分子結構，是一種有效的植物雌激素[7]。諸多文獻報道，芒柄花黃素能夠抑制腫瘤細胞的增殖、促進其凋亡[8]。Wang等[9]的研究發現，芒柄花黃素能夠通過microRNA 149介導的EphB3下調和抑制PI3K/AKT與STAT3信號通路來抑制結腸癌細胞的生長和侵襲。Zhang等[10]通過體外實驗證實，芒柄花黃素作用于卵巢癌細胞后，凋亡相關蛋白caspase 3/9表達與Bax/Bcl-2的比率呈劑量依賴性增加，表明芒柄花黃素能夠通過誘導凋亡來抑制卵巢癌細胞的增殖。增生性瘢痕是創傷后組織修復的異常結局，組織學特點是成纖維細胞大量增殖，臨床表現為瘤樣增生[11]。因此，我們推斷芒柄花黃素對增生性瘢痕也具有一定的抑制作用。

在本研究中，MTT試驗結果顯示，芒柄花黃素對正常皮膚成纖維細胞的增殖影響較小，對增生性瘢痕成纖維細胞的增殖具有一定的抑制作用，且藥物濃度越高、作用時間越長，抑制作用越明顯。通過流式細胞技術檢測發現，經芒柄花黃素處理的成纖維細胞大多數阻滯于G1期，S期細胞的百分比顯著下降，表明芒柄花黃素可能通過調節細胞周期來實現對細胞增殖的抑制作用。Cyclin D1是重要的細胞周期調節蛋白，調控細胞周期由G1期向S期轉化[12]。我們通過Western blot與RT-PCR對Cyclin D1蛋白水平及其mRNA的表達水平進行了檢測，與對照組比較，人增生性瘢痕成纖維細胞經芒柄花黃素處理24 h后，Cyclin D1的蛋白水平及其mRNA表達水平顯著下降。Annexin-V-FITC/PI與Hoechest 33258染色法顯示，芒柄花黃素呈劑量依賴的形式誘導成纖維細胞的凋亡，當濃度為20 μmol/L時，細胞的凋亡率最高。Bcl-2蛋白家族在細胞凋亡的線粒體通路中起著關鍵作用，Bcl-2是細胞凋亡的重要抑制因子之一[13]。Western blot檢測顯示，不同濃度的芒柄花黃素對Bcl-2表達均有抑制作用，且濃度越高，抑制作用越強。RT-PCR進一步驗證了芒柄花黃素能夠通過調節mRNA的表達水平來調控Bcl-2的蛋白表達。

綜上所述，芒柄花黃素通過抑制Cyclin D1表達影響人增生性瘢痕成纖維細胞的細胞周期進程，使細胞周期阻滯于G1/S期，通過下調Bcl-2的表達誘導細胞凋亡，可考慮用于增生性瘢痕的預防和臨床治療。