絲裂霉素C抑制PI3K/AKT信號通路抗宮腔黏連SD大鼠子宮內膜纖維化的機制研究

徐 芳,潘嬙微,鄭加永,夏淑琦,陳玄宇,沈曉露

0 引言

宮腔黏連(Intrauterine adhesions,IUA)是引起月經稀少、閉經、不孕及早期自然流產的重要原因之一，是不孕不育的首要宮腔病因[1-2]。子宮內膜功能隨體內激素水平及月經周期發生周期性增生和脫落，其功能自主恢復主要依靠基底細胞轉化，一旦子宮內膜基底發生損傷，造成腺體的大量丟失，刺激成纖維細胞的大量增殖，使大量膠原蛋白聚集形成瘢痕，最終形成宮腔黏連，對女性子宮會造成嚴重損傷[3-4]。抗宮腔黏連瘢痕生長的藥物能大幅度降低宮腔黏連的發生率，提高其治愈率，將是宮腔黏連治療方案中的突破點。絲裂霉素C(Mitomycin C,MMC)作為經典抗瘢痕形成藥物，能有效抑制中外胚層細胞的異常增生，因此,MMC極可能抗宮腔黏連瘢痕形成[5]。本研究通過觀察宮腔黏連對SD雌性大鼠子宮內膜的影響，以及MMC對其PI3K/AKT通道相關蛋白的作用機制，從而發現宮腔黏連的有效的治療方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 選用健康清潔級的雌性SD大鼠40只，9～10周齡，體重約220～240 g，適應飼養1周后，按隨機數字表法分為對照組、模型組、實驗組1、實驗組2，每組10只。

1.2 實驗儀器及試劑 ELx808IU酶聯免疫檢測儀(US,Bio-Tek)，蛋白電泳及轉印儀(US,Bio-Tek)，絲裂霉素C注射液(浙江海正藥業股份有限公司，國藥準字H19999025)，IGF-I(長春金賽藥業股份有限公司，國藥準字S20050024)，石蠟切片機(Leica,型號2235)，體視學顯微鏡(Leica,型號m205FA)；圖像分析系統Image-Proplus5.1(Media Cybemetics Inc.USA,型號41N5100-44800)，投射顯微鏡(HITACHI,JAPAN,型號H-7500)，LAS1000 CCD曝光檢測系統(Fujifilm,Tokyo,Japan)，兔抗PI3K多克隆抗體(Abcam,ab32089)，兔抗AKT多克隆抗體(Abcam,ab179463)，兔抗Bcl-2多克隆抗體(Abcam,ab32124)，兔抗Bax多克隆抗體(Abcam,ab232479)，兔抗IGF-I多克隆抗體(Abcam,ab232479)，無水乙醇溶液(國藥集團化學試劑有限公司)，伊紅染液水溶性(珠海貝索生物技術有限公司)，蘇木素染液(珠海貝索生物技術有限公司)，中性樹膠(Solarbio)

1.3 模型制備 適應飼養1周后開始對模型組、實驗組1、實驗組2大鼠制備宮腔黏連模型。宮腔黏連模型制備參考相關文獻[6-8]：用陰道涂片法確定雌性SD大鼠動情期，腹腔注射水合氯醛，經腹部中線切口暴露右側子宮，子宮中下段做3 mm的縱向切口，用21號刀片刮除子宮內膜直至宮壁明顯粗糙，清洗后縫合切口，構建宮腔黏連模型。術中及術后3、5 d，模型組大鼠不做任何處理。實驗組1大鼠在術中給予1 mg/ml絲裂霉素C敷刮傷區域5 min，術后3、5 d分別用1 mg/ml的絲裂霉素C 0.2 ml進行宮腔灌注。實驗組2大鼠在實驗組1的用藥基礎上，再給予雌激素口服進行治療。對照組為正常雌性SD大鼠，不做任何處理。各組大鼠均于術后21 d處死，取出子宮組織。

1.4 檢測方法 各組大鼠用2%戊巴比妥鈉腹腔深度麻醉(0.2 ml/10 g)，剪開腹腔，取出子宮組織剪碎，一部分子宮組織用0.1 mol/L的PBS(pH 7.4)液30 ml沖洗，經4%多聚甲醛固定48 h后常規石蠟包埋，連續切片(厚約4 μm)貼附于防脫載玻片上，60 ℃烤箱過夜干燥備用。一部分子宮組織迅速放入凍存管，存于-80 ℃冰箱進行Western blot檢測。

1.4.1 HE染色 石蠟切片65 ℃烘烤2 h；二甲苯Ⅰ脫蠟15 min；二甲苯Ⅱ脫蠟15 min；二甲苯Ⅲ脫蠟15 min；無水乙醇Ⅰ10 min；無水乙醇Ⅱ10 min；95%乙醇Ⅰ8 min；95%乙醇Ⅱ8 min；85%乙醇7 min；75%乙醇6 min；65%乙醇5 min；蘇木素染色8 min，流水沖洗3 min；0.1%鹽酸酒精分化2 s，流水沖洗3 min；氨水反藍2 min，流水沖洗3 min；伊紅染色8 min，流水沖洗3 min；70%乙醇脫水2 s；80%乙醇脫水2 s；95%乙醇脫水2 s；無水乙醇脫水2 s；二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明各10 min；中性樹膠封片。HE 染色通過普通光學顯微鏡于400×物鏡下采圖，以觀察子宮組織細胞纖維化程度。

1.4.2 Western blot檢測 從-80 ℃冰箱中取出子宮組織，加入蛋白裂解液提取總蛋白，Bradford蛋白定量法對蛋白濃度進行測定，取100 μg總蛋白進行SDS-PAGE檢測，電泳后轉膜，5%脫脂牛奶封閉1 h，分別加入p-AKT、p-PI3K、Bcl-2、Bax抗體(濃度1∶1 000)，4 ℃搖床孵育過夜，洗膜，膜與HPR標記的抗體孵育1 h，ECL顯色，X膠片顯影。以GAPDH為內參，分析相關蛋白的光密度值。

2 實驗結果

2.1 MMC對各組宮腔黏連大鼠子宮內膜組織形態的影響 對照組大鼠子宮組織HE染色可見子宮內膜的黏膜層為單層柱狀上皮細胞，黏膜下層可見大量腺體和血管，以及少量成纖維細胞，未見明顯炎性細胞。模型組大鼠HE染色可見細胞結構紊亂，大量單層柱狀上皮細胞被上皮細胞覆蓋，黏膜下層腺體數量減少，細胞成纖維化增生增加。實驗組1、實驗組2大鼠HE染色可見細胞結構輕度紊亂，出現部分成纖維增生細胞，單層柱狀上皮細胞增生明顯，腺體數量有不同程度增加，與模型組比較，細胞胞漿及細胞核染色程度較淺，細胞成纖維化增生數量明顯減少，其中以實驗組2大鼠最為顯著。見圖1。

圖1 MMC對各組宮腔黏連大鼠子宮內膜組織形態的影響

2.2 MMC對各組宮腔黏連大鼠子宮組織中PI3K/AKT通道相關蛋白的影響 與對照組比較，模型組大鼠子宮組織中p-AKT、PI3K、Bcl-2蛋白均顯著升高，Bax蛋白表達顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01)。與模型組比較，各實驗組大鼠p-AKT、PI3K、Bcl-2蛋白均顯著降低，Bax蛋白表達顯著升高(P<0.05)；且實驗組2大鼠p-AKT、PI3K、Bcl-2蛋白含量明顯低于實驗組1，Bax蛋白含量明顯高于實驗組1(P<0.05)。見表1、圖2。

圖2 MMC對各組宮腔黏連大鼠PI3K/AKT通道相關蛋白的影響

表1 MMC對各組宮腔黏連大鼠PI3K/AKT通道相關蛋白的影響

注：與對照組比較，*P<0.01;與模型組比較，#P<0.05;與實驗組1比較，△P<0.05

3 討論

宮腔黏連是宮腔損傷后繼發感染引起子宮內膜基底層細胞損傷，成纖維細胞過度增殖，形成瘢痕，最終形成宮腔黏連。宮腔黏連會引起患者月經周期紊亂，甚至閉經，對患者受孕及孕期造成嚴重影響[9-10]。有研究認為，減輕對子宮內膜的損傷能有效降低宮腔黏連的發生率[11]。目前，臨床上常采用宮腔鏡下宮腔黏連分離術對黏連組織進行分離，并剝離增生瘢痕組織，暴露內膜基底層及腺體[12-13]。術后可放置宮內節育器、Foley導尿管、COOK球囊等將分離后的兩側宮壁病灶區隔開預防再次黏連[14]。研究發現，宮腔鏡宮腔黏連剝離術后給予激素治療，可刺激基底層細胞及腺體增生遷移，能有效降低宮腔黏連的發生率，改善患者月經狀況[15-17]。目前，治療宮腔黏連主要通過促進子宮內膜細胞增殖，但通過促進黏連使成纖維細胞凋亡抑制宮腔黏連的研究較少。PI3K/AKT通路參與多種生物信息的傳導，參與調控細胞周期、啟動凋亡和細胞侵襲性等。PI3K主要由p85和p110組成，受多種細胞分子和理化因子激活，從而激活下游因子AKT。AKT是PI3K/AKT信號轉導通路的核心，下游因子有NF-κB、VEGF、FOXO、BAD、mTOR、Bcl-2等，參與多項生物學事件，調控細胞存活及凋亡等。有研究發現，抑制PI3K/AKT信號通路可有效降低宮腔黏連的發生率，而MMC可通過抑制PI3K/AKT信號通路誘導細胞發生凋亡[18]。研究證實，MMC可誘導子宮內膜腺上皮細胞凋亡。MMC抗代謝、抗增殖，能有效抑制細胞增殖，尤其是抑制成纖維細胞增殖，可抑制成纖維細胞形成膠原蛋白，很大程度上降低了黏連的發生率[19-20]，其作用機制與通過抑制PI3K/AKT信號通路有關[21-22]。已有研究發現，雌激素可顯著降低卵巢早衰大鼠相關的ERβ、PI3K、AKT及mTOR、mRNA含量，這與上調PI3K/AKT和mTOR信號通路相關基因和蛋白表達水平有關；亦有研究發現，雌激素可直接激活信號通路,促進細胞增生，下調子宮內膜癌組織中PR表達[23-25]。

本研究結果發現，模型組大鼠子宮組織形態細胞結構紊亂，大量單層柱狀上皮細胞被上皮細胞覆蓋，黏膜下層腺體數量減少，細胞成纖維化增生增加；兩個實驗組大鼠細胞結構輕度紊亂，出現部分成纖維增生細胞，單層柱狀上皮細胞增生明顯，腺體數量具有不同程度增加，說明MMC可抑制成纖維細胞增生，促上皮細胞再生及腺體恢復。本研究通過Western blot檢測MMC對宮腔黏連大鼠子宮組織中p-AKT、PI3K、Bcl-2蛋白表達的影響，結果發現，與對照組比較，模型組大鼠p-AKT、PI3K、Bcl-2蛋白均顯著升高，Bax蛋白表達顯著降低。實驗組2大鼠p-AKT、PI3K、Bcl-2蛋白含量明顯低于實驗組1，Bax蛋白含量明顯高于實驗組1。進一步說明MMC聯合雌激素通過誘導相關受體將酪氨酸蛋白酶激活，誘導PI3K活化，通過信號傳導至AKT，激活AKT，AKT中的PH結構可以特異識別PI3K產物，二者的高親和力使AKT向細胞膜聚集，進一步激活。AKT進入胞質胞核影響細胞因子如BAD、mTOR、Bcl-2等，引起后續的細胞凋亡。

綜上所述，本研究通過建立SD大鼠機械損傷宮腔黏連模型，在動物實體水平驗證MMC對宮腔黏連大鼠PI3K/AKT信號通路的調節作用，通過抑制PI3K/AKT信號通路相關蛋白誘導子宮內膜中成纖維細胞凋亡，降低膠原蛋白分泌，降低宮腔黏連的發生率，為后期在細胞水平分析MMC抗纖維化及評估藥物安全性提供支持。