牛細管精液冷凍溫度曲線與凍精質量的研究

2019-06-12 01:15:24田素香

中國乳業 2019年5期

文/田素香方妍陳佳

（光明牧業有限公司；上海奶牛育種中心有限公司）

冷凍精液作為一種特殊的商品，對產品質量要求愈來愈高。當前評定種公牛精液品質，主要依據國標《牛冷凍精液的要求》（GB4143-2008）對采精量、原精活力、精子密度、精子凍后活力、精子畸形率五項指標進行檢測。種公牛由于個體間存在差異，使以上各項指標，尤其是凍后活力出現較大差異。在實際操作中，發現有的生產性能良好和外貌優秀的公牛，由于精子抗凍性差等原因被淘汰。為提高牛精液的冷凍效果，提高制作冷凍精液的每頭牛各批冷凍精液之間的穩定性，在制作冷凍精液的過程中，需研究冷凍溫度曲線的變化。

1 材料和方法

1.1 精液

采自本站種公牛鮮精。

1.2 稀釋液配制

按量稱取所需藥品，加超純水至100 mL，溶解后過濾，75 ℃消毒30 min，降溫至40 ℃以下。加入新鮮卵黃、滅菌甘油和青、鏈霉素充分混勻后備用。

1.3 分裝方法

操作需在4 ℃冰柜中進行，四針頭分裝機將漏斗中的精液利用負壓真空的原理通過軟管和針頭吸入0.25 mL塑料細管內，繼而封口打印，完成分裝。電腦控制的先進打印系統同時打印牛只信息，確保所有凍精的可追溯性。

1.4 平衡

分裝后放入冰箱，在4 ℃中平衡2.5～4.0 h。

1.5 冷凍

將細管平置于冷凍箱內，每架盛放175 支細管，液氮熏蒸時間為7 min，然后浸入液氮中冷凍。

1.6 活力檢查

活力0.40以上為合格，畸形率評定按國標《牛冷凍精液的要求》（GB4143-2008）進行。

2 精液冷凍溫度曲線

精液冷凍溫度曲線包括以下幾個方面。

2.1 始凍溫度

精液冷凍前、冷凍容器中冷凍面的溫度。

2.2 熱平衡溫度

精液和冷凍面接觸后，精液一邊溫度下降一邊放熱，使冷凍面溫度回升，當二者溫度一致并在短暫時間內維持不變的溫度。

表1 冷凍精液降溫速率表

2.3 入氮溫度

冷凍細管精液和冷凍箱體溫度呈同步速度迅速下降，達-140 ℃以下時，將細管凍精迅速投入-196 ℃液氮中長期保存。

2.4 降溫控制

公牛精液冷凍過程降溫控制如表1 所示。

3 適宜的冷凍面曲線

冷凍精液的實質是精液與冷源環境進行能量交換的過程，精液在冷凍過程中放出一定的能量后，由液相變化到固相。產生相變的原因是精液與其所處環境之間存在著極大的溫度差（-196～4 ℃）。冷凍過程中它們各自向相反的方向擴散，進行能量交換，直到溫度差等于零，達到能量平衡為止。其能量交換的極限值是熱擴散平衡時的溫度，此時，精液溫度擴散的速度與精液凍結相變的速度保持一致。

精液的冷凍過程中，首先是精液溫度的變化，精液由冷凍前的平衡溫度呈直線下降，是一個散熱過程，要求快速通過-60～0 ℃的危險溫度區。當下降溫度達到凝固點時，精液便隨著降溫梯度由液態變為固態。其次是冷凍面溫度變化，選用鋁板、氟板、銅網作為凍制精液的冷凍面，當精液放入后溫度上升到最高點，即為精液下降溫度與冷凍面上升溫度達到一致，稱為熱平衡，冷凍面溫度由上升轉為下降，達到-140 ℃呈曲線變化。制作冷凍精液要求冷凍面快速達到-110～-80 ℃適宜的熱平衡溫度區，然后迅速下降到-140 ℃，方可能獲得解凍后精子活力高的優質精液。

4 精液冷凍工藝所采用的冷凍面溫度曲線

精液冷凍、解凍后活力與凍結時間有關，上海奶牛育種中心有限公司采用法國卡蘇先進的電腦編制程序的冷凍器來冷凍精液，其凍后精子活力比用液氮蒸氣法冷凍后的精子活力要高，而且精子存活時間更長。這是因為操作者難以控制液氮蒸汽法的初始冷凍溫度和液氮水平，同時冷凍量和冷凍速度也會影響冷凍溫度。公牛精液（最終甘油濃度5.0%～5.6%）冷凍過程降溫控制如表1、圖1。