清肝化瘀顆粒的急性毒性試驗研究

鄧茹蕓 ，曹 建 ，魏潤杰 ，姚樹坤 ,,,4?

（1.北京中醫藥大學，北京 100029；2.北京航空航天大學 生物與醫學工程學院，北京 100191；3.北京大學醫學部中日友好臨床醫學院，北京 100029；4.中日友好醫院 消化內科，北京 100029）

原發性肝癌全球每年新發病例高達60萬人，其中超過50%發生于中國，確診時多為晚期[1，2]。相關研究發現，中藥辯證治療晚期原發性肝癌患者可以顯著減輕臨床癥狀和體征[3]。中國2017版《原發性肝癌診療規范》指出中醫藥治療是肝癌治療的重要輔助手段[4]。清肝化瘀顆粒，由黃芩、苦參、白術、莪術等中藥組成，該處方是姚樹坤教授根據其三十余年臨床經驗創制的治療原發性肝癌的有效經驗方，該方具有清熱解毒，健脾祛濕，活血化瘀，軟堅消癥等功效。前期臨床相關應用表明清肝化瘀方能夠提高患者免疫功能，延長生存期，改善生活質量，可應用于大多數原發性肝癌的患者，具有極高的開發研究價值。目前清肝化瘀顆粒正在進行新藥研發，本次試驗進行急性毒性試驗為臨床用藥的安全性提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗動物為80只ICR小鼠，SPF級，體重18～21g，雌雄各半，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證編號:SCXK（京）2016-0011。

清肝化瘀顆粒（批號:20170731）由中日友好醫院藥學部提供。以下描述中，“干膏粉”指的是本供試品提取物，每克提取物相當于4.472g生藥，“生藥”是根據此含量計算得到的生藥量。

1.2 實驗方法

1.2.1 劑量設置

本品為中藥復方，由黃芩、苦參等組成，本試驗設置 7個劑量:0.15、0.20、0.27、0.36、0.48、0.65、0.86藥粉/ml，給藥體積:40ml/kg[6]。劑量設置依據:前期預試驗表明，清肝化瘀顆粒（批號同正式供試品），以濃度 0.718、0.431、0.259、0.155、0.093g 干膏粉/ml一次性灌胃給予小鼠后，前2個劑量組有3 只（3/10）、2 只（2/10）雄性動物于給藥后 24h 內死亡；后3個劑量組未出現死亡，最低劑量組未見肉眼可見的不良反應。

正式供試品預配制結果顯示，清肝化瘀顆粒干膏粉可配制的最高濃度為0.86g干膏粉/ml。因此，本次正式試驗進行小鼠半數致死量試驗，最高劑量設定為0.86g干膏粉/ml，然后0.75倍間距向下設定6個劑量[5，6]，至低于未出現不良反應濃度劑量，6.0g干膏粉/kg。

1.2.2 動物分組

適應期結束后，小鼠禁食約15h，稱禁食體重，采用分層隨機法，根據此體重分層對納入試驗的80只動物按性別分別進行分組。參考 “SOPTQ035實驗動物的隨機分組”。80只ICR小鼠采用隨機分為8組:對照組（灌胃給予等體積實驗動物飲用水）和上述7個劑量的給藥組。

1.2.3 給藥方法

經口灌胃給藥，根據前期藥效學相關研究，清肝化瘀給藥組給予相應濃度的藥液，對照組給予等體積實驗動物飲用水，40ml/kg/次，給藥1次，于稱禁食體重分組后立即給予。

1.3 觀察與檢測

1.3.1 毒性癥狀、一般狀態觀察與剖檢結果

給藥后，密切觀察1h內動物毒性反應，給藥當日上下午均進行觀察。之后每天1次觀察動物，記錄動物的一般狀況、毛色、活動、步態、神態、大便、尿液等。觀察有無中毒癥狀發生，及發生的時間和持續時間、恢復情況，記錄死亡或瀕死動物。

1.3.2 體重

給藥后第 1 天（D1）、第 2 天（D2）、第 3 天（D3）、第 5 天（D5）、第 8 天（D8）、第 11 天（D11）、第14天（D14）稱量動物未禁食體重。

1.3.3 攝食量

給藥后（D0）即恢復供食，每籠加定量飼料（200g/籠），與上述體重稱量的同時稱剩余飼料，每次稱剩余飼料后繼續定量添加飼料（200g/籠）。計算每籠飼料消耗量，除以每籠動物數，即得該籠平均攝食量（g飼料/鼠日）。

給藥當天（D0）給藥后定量添加飼料。給藥后D1、D2、D3、D5、D8、D11 稱剩余飼料量后定量添加飼料。給藥后D14稱剩余飼料后不再定量添加飼料。

1.4 統計學方法

應用SPSS13.0統計學軟件進行統計學分析。動物半數致死量（LD50）采用Bliss法計算，probit程序進行檢驗；采用單因素方差分析（ANOVA），組間比較方差齊性采用LSD檢驗，方差不齊時選用 Tamhane’s T2 檢驗。

2 結果

2.1 小鼠死亡率和不良反應

清肝化瘀顆粒以 26.8、35.8、48.3、64.4、85.9、116.3、153.8g生藥/kg，40ml/kg給藥體積，一次性經口給予小鼠，可觀察到的主要毒性反應為急性死亡。上述劑量給藥當日、D1、D2-14的動物死亡情況見表1。劑量組4～7在給藥后1h陸續有動物出現死亡，發生在用藥后1h～24h內，其中劑量組6的死亡高峰發生在給藥后1～2h，其余各組的死亡高峰在給藥后4～24h內。采用Bliss法計算得出LD50為69.94g生藥/kg（相當于臨床劑量的104倍），95%可信限為63.50～81.03g生藥/kg。結果見表1所示。

表1 清肝化瘀顆粒急性毒性試驗動物死亡情況

表2 清肝化瘀顆粒急性毒性試驗不良反應情況

除急性死亡外，其它肉眼可見的不良反應主要表現為腹瀉、靜臥、步態不穩、翻正反射消失伴肢體僵直；劑量組2、3的小鼠表現為腹瀉和/或靜臥，發生率分別為30%和40%，約在給藥后20～30min發生，在給藥后5h內恢復；劑量組4有7只動物出現腹瀉和/或靜臥的不良反應，發生在給藥后30min～2h，除有2只動物在給藥后24h內恢復外，其余動物在給藥后5h內恢復；5～7劑量組除有腹瀉和/或靜臥的不良反應外，且出現步態不穩和/或翻正反射消失伴肢體僵直癥狀，發生在給藥后30min～5h內，劑量組5、7雖分別有2只和1只動物的腹瀉在給藥后4h內恢復，但上述3個劑量組的所有動物均在24h內死亡；劑量組1未出現上述肉眼可見的不良反應。劑量組1～7的不良反應發生率分別為0%、30%、40%、70%、100%、100%和100%；此后直至觀察期14d結束，存活動物的一般情況、活動、步態、呼吸、進食、飲水、二便、皮毛等均未見異常見。結果見表2所示。

圖1 清肝化瘀顆粒急性毒性實驗——雄性動物平均體重變化

圖2 清肝化瘀顆粒急性毒性實驗——雌性動物平均體重變化

2.2 對小鼠體重和攝食量的影響

與對照組相比，給藥后14d內，清肝化瘀顆粒雄性動物64.4g生藥/kg劑量組在給藥后D1～14體重均較對照組偏低，其中D1體重較對照組明顯降低（P＜0.01），其余各時間點未見明顯的統計學差異；雄性動物的其它劑量組和雌性動物各劑量組在各時間點與對照組體重基本相當，與對照組比較均未見明顯的統計學差異。各組平均體重見圖1、2。

與對照組比較，清肝化瘀顆粒雄性動物64.4g生藥/kg劑量組于給藥后D1攝食量較對照組降幅明顯，約為對照組的52%，D2后攝食量已與對照組基本接近；雄性動物的其它劑量組和雌性動物各劑量組在各時間點與對照組攝食量基本相當。

2.3 大體解剖觀察

14d觀察期結束，解剖后肉眼觀察，動物胸、腹腔未見滲液、出血和粘連，心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、胃腸、膀胱、睪丸、附睪等均未見充血、瘀血、出血、滲液、粘連、糜爛、潰瘍等肉眼可見的病變。

3 討論

中藥具有調整機體狀態，增強免疫功能，減少手術副反應，控制腫瘤發展，改善癥狀，提高生活質量，延長“帶瘤生存”期的；所以研究有效的肝癌中成藥具有長遠的積極意義。清肝化瘀顆粒是姚樹坤教授集多年經驗形成的治療肝癌的有效經驗方。本課題組前期動物實驗和細胞實驗明確了清肝化瘀方的主要有效組分是:氧化苦參堿類、黃芩苷類、莪術醇類；其有效成分在各類腫瘤中均具有具有明確的抗腫瘤、抑制細胞增殖的作用[7～10]。本研究將為臨床用藥的安全性提供參考。

3.1 不良反應

本實驗得出，清肝化瘀顆粒最大無毒反應劑量為26.8g生藥/kg（相當于成人臨床推薦劑量的40倍）。26.8g生藥/kg劑量組未出現任何肉眼可見不良反應；35.8、48.3g生藥/kg劑量組毒性反應輕微，發生率分別為30%和40%；64.4g生藥/kg劑量組毒性反應較大，不良反應發生率為70%；85.9g生藥/kg及以上劑量組，毒性反應劇烈全部致死。除死亡動物出現步態不穩以及翻正反射消失伴僵直等不良反應外，其余不良反應均為腹瀉和/或靜臥，且在5h內恢復。除最大劑量組外，其余各組給藥后攝食量及體重無明顯變化，觀察期結束后，存活動物解剖后未見明顯病變。可見，清肝化瘀顆粒正常劑量臨床應用，在不良反應方面可能具有較為明顯的優勢。

3.2 安全性

本實驗表明，過量清肝化瘀顆粒主要毒性反應為急性死亡。實驗得出LD50為69.94g生藥/kg（相當于成人臨床推薦劑量的104倍），95%可信限為63.50～81.03g生藥/kg，最大無致死劑量為48.3g生藥/kg（相當于成人臨床推薦劑量的72倍）。觀察期14d結束，存活動物的一般情況、活動、步態、呼吸、進食、飲水、二便、皮毛等均未見異常；因此，清肝化瘀顆粒常規劑量應用，安全性可能較高。

本次試驗只觀察了動物解剖后可見病變，沒有進行血液和組織分析。下一步，課題組將結合臨床實踐，深入分析清肝化瘀顆粒毒性反應機理，為其臨床研究奠定基礎。