艾塞那肽減輕阿霉素引起的心肌細胞凋亡

方俊濤 ，蔡 璨 ，王麗娟 ，張小慢 ，劉尚雨 ，李 萍

（1.中國醫學科學院 北京協和醫學院阜外醫院，國家心血管病中心 心血管病國家重點實驗室，北京 100037；2.中國醫學科學院 北京協和醫學院阜外醫院 心血管內科，國家心血管病中心 內分泌與心血管代謝中心，北京 100037）

阿霉素是一種廣譜高效的抗癌藥物，然而其致命的心臟毒性極大地限制了在臨床上的應用[1]。阿霉素所致心臟毒性的機制非常復雜的，包括活性氧（reactive oxygen species，ROS）的過量產生，細胞膜完整性的破壞及細胞凋亡[2]。ROS的激活可引起DNA的過氧化損傷，導致線粒體膜通透性變化和誘導細胞凋亡[3]。這些因素相互作用，共同導致了阿霉素心臟毒性的發生和發展。

胰高血糖素樣肽1（glucagon-likepeptide1，GLP-1）是由腸內分泌L細胞產生的一種腸促胰素，它通過與GLP-1受體結合發揮降糖作用。艾塞那肽是一種GLP-1受體激動劑，研究表明，它除了降糖作用外還具有抗炎、抗氧化應激、抗凋亡、改善心肌梗死等心血管保護作用[4，5]。然而，艾塞那肽對阿霉素致心肌細胞凋亡是否具有保護作用，國內外鮮見報道。本研究旨在探討艾塞那肽對阿霉素所致心肌細胞凋亡的保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

MTT活性檢測試劑盒、Caspase3、Caspase9活性檢測試劑盒、線粒體膜電位（△Ψm）檢測試劑盒（JC-1）、一步法TUNEL試劑盒及ROS檢測試劑盒均購自碧云天生物技術研究所，Annexin-V和PI雙染色法試劑盒購于BD Biosciences公司，阿霉素購于大連美侖生物技術有限公司，艾塞那肽購于MCE公司，DMEM培養基及胎牛血清購自Gibco公司。

1.2 細胞培養與處理

H9c2大鼠心肌細胞株來源于美國標準生物品收藏中心（ATCC）。將H9c2細胞置于含10%胎牛血清的培養基中，在37℃、5%CO2的條件下培養。對心肌細胞進行饑餓24h處理后，阿霉素組給予阿霉素（10μM）刺激24h，艾塞那肽干預組在給予阿霉素0.5h前用艾塞那肽（30nM）進行預處理。

1.3 MTT試劑盒檢測H9c2細胞活性

按5×107個/孔將H9c2細胞接種于96孔板，當細胞生長到80%左右融合時進行分組處理，每個組設3個復孔。處理結束后，每孔加入10μl MTT溶液繼續孵育4h，然后每孔再加入100μl Formazan溶解液，混勻后37℃孵育4h左右，在570nm測定吸光度（OD）。取3孔OD值的平均數，計算細胞活性:細胞活性=處理組OD/對照組OD×100%。

1.4 TUNEL法檢測細胞凋亡

利用一步法TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒檢測3組細胞的凋亡情況。按5×107個/孔將H9c2細胞接種于12孔板，當細胞生長到80%左右時進行分組處理，每個組設3個復孔。處理結束后，用PBS洗滌2次。在樣品上加50μl TUNEL檢測液，37℃避光孵育60min。用PBS洗滌3次后用抗熒光淬滅封片液封片，并在熒光顯微鏡下觀察。Cy3的激發波長為550nm，發射波長為570nm。

1.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡

采用Annexin-V和PI雙染色法測定細胞凋亡。用4℃的PBS清洗心肌細胞2次，調整細胞濃度為2×106個/孔，在細胞中分別加入FITC標記的Annexin-V和PI各5μl。采用Accuri C6流式細胞儀進行檢測分析。

1.6 細胞內ROS水平檢測

將H9c2細胞均勻接種于12孔板上，當細胞長到約80%時給予不同處理。按照1:1000用無血清培養液稀釋DCFH-DA，使終濃度10μmol/L。去除細胞培養液，在12孔板的1個孔中加入1ml稀釋好的DCFH-DA，37℃孵育20min。用無血清細胞培養液洗滌細胞3次，以充分去除未進入細胞內的DCFH-DA。收集細胞后在488nm激發波長，525nm發射波長用熒光酶標儀檢測。

1.7 Caspase3與Caspase9活性檢測

H9c2細胞經不同處理后，用胰酶消化貼壁細胞，并收集至備用的細胞培養液中，以600g離心5min收集細胞，PBS洗滌1次。按照每200萬細胞加入100μl裂解液的比例加入裂解液，重懸沉淀，冰浴裂解15min后18000g離心15min，把上清轉移到冰浴預冷的離心管中，并測定蛋白濃度。根據試劑盒步驟配好反應體系，37℃孵育2h，出現顏色變化較明顯時即可測定A405。

1.8 線粒體膜電位（JC-1）檢測

當細胞長至約80%時，根據實驗設計給予不同處理。用胰酶消化后收集細胞，重懸于0.5ml細胞培養液中，加入0.5ml JC-1染色工作液，混勻。細胞培養箱中孵育20min。孵育結束后，600g離心4min，沉淀細胞，棄上清，用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌 2次，再用適量 JC-1染色緩沖液（1×）重懸后，用熒光酶標儀檢測。當線粒體膜電位比較高時，JC-1會聚集在線粒體基質中形成聚合物而產生紅色熒光；當線粒體膜電位比較低時，JC-1不能聚集于線粒體基質中，此時JC-1為單體，會發出綠色熒光。這樣就可以很方便地借助熒光顏色的變化來檢測線粒體中的膜電位變化。常用紅色綠色熒光的相對比值來衡量線粒體去極化的程度。

1.9 實時熒光定量PCR檢測

各組細胞在37℃、5%CO2的條件下培養24h后，通過RT-PCR檢測每組細胞的Bcl-2及Bax mRNA表達水平，計算Bcl-2/Bax比值。設計的引物如下:Bcl-2上游引物:5‘CTTCAGGGATGGGGTGAACT’3，下游引物:5‘CAGCCTCCGTTATCCTGGAT’3；Bax上游引物:5‘TCATGAAGACAGGGGCCTTT’3，下游引物:5‘GTCCACGTCAGCAATCATCC’3；GAPDH上游引物:5‘GGTTGAGTGAGCAGTTCAC’3，下游引物:5‘GATAACCAGACCACACCTTAGC’3。

1.10 統計學方法

應用SPSS 23.0軟件進行統計學分析，組間比較采用方差分析。

2 結果

2.1 艾塞那肽對阿霉素誘導的H9c2心肌細胞凋亡的影響

與空白組相比，阿霉素組H9c2心肌細胞凋亡率顯著增加（流式細胞檢測法:P＜0.01；TUNEL法:P＜0.01）；與阿霉素組相比，艾塞那肽組H9c2心肌細胞凋亡率顯著減少（流式細胞檢測法:P＜0.01；TUNEL 法:P＜0.05），見圖1、2（插二）。

2.2 艾塞那肽對阿霉素誘導的H9c2心肌細胞活性的影響

表1示，與對照組相比，阿霉素組H9c2心肌細胞活性顯著下降（P＜0.01）；給予艾塞那肽處理后H9c2心肌細胞活性顯著增加（P＜0.05）。

2.3 艾塞那肽對阿霉素誘導的H9c2心肌細胞ROS、Caspase3、Caspase9 活性的影響

表1示，與對照組相比，阿霉素組H9c2心肌細胞 ROS、Caspase3、Caspase9活性顯著增加（P＜0.01）；給予艾塞那肽預處理后H9c2心肌細胞ROS、Caspase3、Caspase9 活性顯著下降（P＜0.05）。

2.4 艾塞那肽對阿霉素誘導的H9c2心肌細胞△Ψm、Bcl-2/Bax比值的影響

表1示，與對照組相比，阿霉素組H9c2心肌細胞△Ψm、Bcl-2/Bax比值顯著下降（P＜0.01）；與阿霉素組相比，艾塞那肽組H9c2心肌細胞△Ψm、Bcl-2/Bax比值顯著增加（P＜0.01）。

3 討論

3.1 阿霉素與心肌細胞凋亡

阿霉素是臨床上常用的抗腫瘤藥物，它的嚴重心臟毒性大大限制了臨床應用。因此，尋找能夠減輕這種不良反應又不影響阿霉素的抗腫瘤功能的心臟保護劑是亟需解決的問題。阿霉素所致的心臟毒性具體機制目前尚未十分清楚，但普遍認為阿霉素所引起的心肌細胞凋亡及ROS的大量生成是心臟損傷的重要機制。

大量研究表明，心肌細胞凋亡參與到多種心血管疾病的發病過程中。細胞凋亡指的是基因水平調控的一種程序性自主死亡過程[6]。細胞凋亡的機制非常復雜，目前普遍認為細胞凋亡主要通過以下3種信號轉導途徑來實現，包括線粒體介導的凋亡途徑、內質網介導的凋亡途徑和死亡受體介導的凋亡途徑[7]。此外，一些凋亡相關的基因也參與到其中，包括:Bcl-2家族和Caspase家族。因此，如何減輕心肌細胞的凋亡，是當前細胞分子生物學領域的熱點。

3.2 阿霉素與△Ψm異常

當阿霉素作用于心肌細胞后，線粒體中呼吸鏈功能出現異常，產生大量ROS，增加了線粒體膜的通透性，導致△Ψm下降，從而激發Caspases的凋亡級聯反應，活化Caspase3等，而Caspase3是細胞凋亡過程中最重要的蛋白酶，是細胞凋亡出現的標志酶，激活后的Caspase3能改變細胞形態及降解DNA，誘導細胞凋亡[8]。研究表明，用不同的處理方式誘導的細胞凋亡中，均可以發現△Ψm在細胞形態變化前有一定程度的下降，說明△Ψm的下降是細胞凋亡早期的一個標志性事件。當△Ψm出現損耗時，細胞即進入了凋亡過程。

表1 艾塞那肽對阿霉素誘導的H9c2心肌細胞活性、ROS等指標的影響

3.3 艾塞那肽對阿霉素引起心肌細胞凋亡的保護作用

除了Caspase家族外，Bcl-2基因家族也是參與細胞凋亡調控的重要調控基因[9]。Bcl-2和Bax同屬于Bcl-2家族成員，在凋亡調控中發揮重要作用。Bcl-2具有對抗細胞凋亡功能，通過抑制細胞色素C的釋放，進而抑制下游Caspases的激活，發揮其抗凋亡作用[10]。而Bax則具有促進細胞凋亡的作用，當細胞凋亡發生時，Bcl-2/Bax比值下降，Bcl-2/Bax比值常被用于描述細胞凋亡的程度。研究表明，線粒體介導的心肌細胞凋亡途徑在阿霉素誘導的心臟毒性中扮演重要角色[11，12]。由于胞內ROS大量生成及ATP消耗使得Bax從細胞液轉移到線粒體中，Bcl-2/Bax比值降低，這導致細胞色素C的釋放及Caspase3、Caspase9的激活，引起心肌細胞凋亡[13]。研究表明，GLP-1類似物艾塞那肽具有抗炎、抗動脈粥樣硬化、減輕心肌缺血再灌注損傷、抑制心肌細胞凋亡等心血管保護作用。在本研究中，我們發現TUNEL法和流式細胞儀檢測結果提示阿霉素組H9c2細胞凋亡率顯著增加，阿霉素能夠引起H9c2細胞活性降低，細胞內ROS水平升高，△Ψm降低，Bcl-2/Bax比值下降，給予艾塞那肽干預后則能顯著改善這些不良作用，這提示艾塞那肽能夠對抗阿霉素引起心肌細胞凋亡。

綜上所述，艾塞那肽能夠改善阿霉素引起的心肌細胞凋亡，這為防治阿霉素誘導的心臟毒性提供新的思路。其作用機制可能是減少細胞內ROS的生成，增加△Ψm，降低Bcl-2/Bax比值，從而減少阿霉素誘導的心肌細胞凋亡。