三七破壁飲片質量分析

梁 笑，徐國兵,2，錢珊珊，桂雙英,4,5，王舉濤，葛 鼎，劇夢真，鮑炳娟

(1.安徽中醫藥大學藥學院，安徽 合肥 230012；2.安徽省食品藥品檢驗研究院，安徽 合肥 230051；3.安徽中醫藥大學第二附屬醫院藥學部，安徽 合肥 230061；4.安徽省中醫藥科學院藥物制劑研究所，安徽 合肥 230012；5.安徽道地中藥材品質提升協同創新中心，安徽 合肥 230012)

三七為五加科植物三七[Panaxnotoginseng(Burk.)F. H. Chen]的干燥根和根莖，具有散瘀止血、消腫定痛等功效，主治咳血、吐血、衄血、便血、崩漏、外傷出血、胸腹刺痛、跌撲腫痛[1]。其始載于《本草綱目》，其卷三(上)中記載將三七與米泔同服可治吐衄[2]，明醫書《證治準繩》中記載將三七曬干取粉同槐枝、血竭等入藥可治療跌傷[3]。在現代中醫臨床中，三七可煎湯、研末或入丸(散)內服，亦可研末、磨汁外用。與傳統研磨而成的三七粉相比，三七破壁飲片是運用超微粉碎技術將傳統三七飲片進行細胞級粉碎并制粒而成的一種新型中藥飲片，在使用上可不必煎煮直接沖泡服用，配伍靈活，應用便捷。其在保留傳統飲片中所有成分的同時，又提高了有效成分的溶出速度和溶出度。本研究開展三七破壁飲片的質量研究，為三七破壁飲片質量標準的建立提供依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1260高效液相色譜儀，配備四元泵、自動進樣器及可變波長檢測器；電子天平(PA1004B)：上海精科天美；Varian cary50紫外可見分光光度計：美國VARIAN公司；BT-9300H激光粒度儀：江蘇省丹東市百特儀器有限公司；暗箱式薄層色譜攝影儀GoodSee-Ⅱ：上海科哲生化科技有限公司；光學顯微鏡(NIKON E100)：北京泰克儀器有限公司；原子吸收分光光度計(A3AFG-12)：北京普析通用儀器有限責任公司；微波消解儀(MD6H)：奧普勒儀器有限公司。

1.2 材料 三七破壁飲片(三七破壁粉碎后，經乙醇粘合制粒，批號 170801-170810)：安徽亳州宏信藥業提供；三七對照藥材(批號 120941201108)、人參皂苷Rb1(純度 95.0%，批號 110704201625)、三七皂苷R1(純度 95.0%，批號 110745201619)、人參皂苷Rg1(純度 91.7%，批號 110703201530)、人參皂苷Re(純度 97.4%，批號 110754201626)：中國食品藥品檢定研究院；甲醇(色譜純，≥99.9%，批號 Me-12760216)、乙腈(色譜純，≥99.9%，批號 AC-12960217)：OCEANPAK；三氯甲烷(分析純)：天津精強化工有限公司；乙酸乙酯(分析純)：江蘇省無錫市利宏化工產品有限公司；鉛[100 μg/mL，批號GBW(E)080129]、鎘[100 μg/mL，批號GBW(E)080119]、砷[100 μg/mL，批號GBW(E)080117]、汞[100 μg/mL，批號GBW(E)080124]、銅[100 μg/mL，批號GBW(E)080122)]：中國計量科學研究院；超純水：由Millipore公司Milli-Q超純水系統制備；Merck硅膠預制薄層板(Si-60，批號 HC43300156)：默克化工技術有限公司。

2 方法與結果

2.1 性狀考察 灰褐色至灰黃色的顆粒，氣微，味苦回甜。

2.2 顯微鑒別 參考文獻[4-5]方法進行顯微鑒別：取本品粉末適量，加水合氯醛裝片，必要時加熱透化。顯微鏡下可見淀粉粒甚多，單粒圓形、半圓形或圓多角形，直徑4～30 μm；樹脂道碎片含黃色分泌物；導管碎片較少見。見圖1。

圖1三七破壁飲片顯微結構(10×40倍；A.樹脂道；B.導管；C.淀粉粒)

2.3 薄層色譜鑒別 取三七破壁飲片0.5 g，按2015年版《中華人民共和國藥典》一部三七藥材鑒別項下方法，制備供試品溶液和對照品溶液，加水5滴，攪勻，再加水飽和的正丁醇5 mL，密塞，振搖10 min，放置2 h，離心，取上清液，加3倍量正丁醇飽和的水，搖勻，放置使分層(必要時離心)，取正丁醇層，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取人參皂苷Rb1對照品、人參皂苷Re對照品、人參皂苷Rg1對照品及三七皂苷R1對照品，加甲醇制成0.5 mg/mL的混合溶液，作為對照品溶液。按照薄層色譜法(2015年版《中華人民共和國藥典》四部通則0502方法)試驗，吸取上述兩種溶液各1 μL，分別點于同一塊Merck硅膠預制薄層板(Si-60)上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15∶40∶22∶10)10 ℃以下放置的下層溶液為展開劑，上行展開17 cm，取出，晾干，噴以硫酸乙醇溶液(1→10)，在105 ℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑點；置紫外光燈(365 nm)下檢視，顯相同的熒光斑點。10批樣品按本法檢驗，均符合規定，且色譜分離效果好，斑點清晰，比移值適中，重復性好。薄層鑒別圖見圖2。

2.4 指紋圖譜鑒別

2.4.1 色譜條件 按照文獻[6-8]方法設定色譜條件。采用太瑋科技JADE-PAK RS-C18Ⅱ色譜柱(250×4.6mm，5 μm)，流動相為乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(0～10 min，10% A，90% B；10～20 min，10%～25% A，90%～75% B；20～35 min，25%～37% A，75%～63% B；35～45 min，37%～45% A，63%～55% B；45～50 min，45%～75% A，55%～25% B)，流速為1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長203 nm，進樣量10 μL。

2.4.2 供試品溶液制備 取供試品0.5 g加入色譜甲醇25 mL，超聲(40 kHz，200 W)提取0.5 h，過濾，轉移至25 mL量瓶中，加色譜級甲醇定容，即得。

注：a、b、c、d、e分別代表批號170801、170802、170803、170804、170805的三七破壁飲片，f代表三七混合對照品(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分別為人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、三七皂苷R1、人參皂苷Rb1)，g代表三七對照藥材，h、i、j、k、l分別代表批號170806、170807、170808、170809、170810的三七破壁飲片；左圖為日光下薄層色譜圖，右圖為紫外光(365 nm)下薄層色譜圖

圖210批樣品的薄層色譜圖

2.4.3 對照藥材溶液與對照品溶液制備 取三七對照藥材粉末(過四號篩)0.5 g，依供試品溶液制備方法制備對照藥材溶液，另取人參皂苷Rb1對照品、三七皂苷R1對照品、人參皂苷Rg1對照品，分別制成人參皂苷Rg1 0.4 mg/mL、三七皂苷R1 0.1 mg/mL、人參皂苷Rb1 0.4 mg/mL的對照品溶液。

2.4.4 空白實驗 精密吸取空白甲醇溶液10 μL，在“2.4.1”項下色譜條件進樣，溶劑峰很小且于5 min前出峰，表明空白溶劑對本實驗無干擾。

2.4.5 精密度試驗 按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，連續進樣7次，記錄色譜圖。以三七皂苷R1為參照峰(S)，各主要色譜峰的相對峰面積及相對保留時間的RSD均小于4%，表明儀器精密度良好。

2.4.6 樣品溶液穩定性 按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10 h進樣，記錄色譜圖，以三七皂苷R1為參照峰(S)，考察各共有色譜峰的相對保留時間及相對峰面積RSD的一致性。結果表明，各共有色譜峰相對保留時間及相對峰面積的RSD均小于0.2 %，表明各主要色譜峰相對保留時間和相對峰面積無明顯變化，供試品溶液在10 h內穩定性良好。

2.4.7 重復性考察 取同一批供試品6份，按“2.4.2”項下方法制備供試品溶液，進樣10 μL，記錄色譜圖，以三七皂苷R1為參照峰(S)，結果表明，6次重復試驗的主要色譜峰面積及保留時間的RSD均小于5%，表明本方法重復性良好。

2.4.8 10批樣品指紋圖譜 取三七對照藥材與三七破壁飲片(批號為170801-170810)，分別制備樣品溶液，按“2.4.1”項下色譜條件進樣10 μL，記錄色譜圖，將色譜圖導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統，以三七對照藥材為參照圖譜(R)，采用中位數法生成對照圖譜后進行自動匹配，分析色譜圖相似度。結果表明各批三七破壁飲片與三七對照藥材相似度分別為0.990、0.986、0.994、0.928、0.931、0.960、0.947、0.996、0.879、0.994。見圖3。

注：自下而上依次為對照藥材(R)，批號依次為170801、170802、170803、170804、170805、170806、170807、170808、170809、170810的三七破壁飲片，S為參照峰三七皂苷R1

圖310批三七破壁飲片樣品指紋圖譜

2.5 重金屬測定 取三七破壁飲片0.5 g，按照2015年版《中華人民共和國藥典》四部通則2321之鉛、鎘、砷、汞、銅測定法制備供試品溶液和標準品溶液，參考2015年版《中華人民共和國藥典》四部通則0406原子吸收分光光度法以標準曲線法定量分析。因2015年版《中華人民共和國藥典》(一部)三七藥材項下無重金屬檢查項，參考西洋參項下重金屬檢查限度，三七破壁飲片重金屬檢查結果均符合規定，故不列入標準。見表1。

表1 三七破壁飲片樣品重金屬測定結果

2.6 未破壁細胞限度 稱取供試品0.010 g，加入水合氯醛試液-水(1∶1)0.5 mL，超聲處理至完全溶散，吸取所有溶液裝片，每片以不溢出、無氣泡、顆粒分布均勻為度，在100倍顯微鏡下檢視，對直徑大于100 μm且完整的細胞進行計數(如多個完整的細胞連成一片，且整片也超過100 μm者，以整片為一個進行計算)，10批樣品的未破壁細胞數分別為53、62、55、74、59、61、52、66、81、46，顯示每0.010 g三七破壁飲片未破壁細胞數均未超過100個。

2.7 粒徑分布檢查

2.7.1 遮光率對粒徑測定的影響 以50%乙醇為分散介質，加入三七破壁飲片(批號 170801)，打開超聲分散裝置，待儀器讀數穩定后記錄遮光率與粒徑分布D90值。結果表明，遮光率隨加樣量增加而增加，遮光率在10%～20%時粒徑測量結果最優，因此以遮光率10%～20%作為三七破壁飲片粒徑分布測定范圍。見表2。

表2 遮光率對三七破壁飲片粒徑分布D90值的影響

2.7.2 分散介質選擇 取適量三七破壁飲片(批號 170802)樣品，分別以純化水、50%乙醇、100%乙醇為分散介質，加入樣品池中，使遮光率為10%～20%，打開超聲分散裝置，待儀器讀數穩定后記錄結果，以D90值作為反映粒徑分布均勻性的指標，三七破壁飲片在純化水中粒徑為38.26 μm，在50%乙醇中粒徑為28.81 μm，純乙醇中粒徑為55.77 μm。結果表明，不同分散介質對粒徑測定有一定影響，考慮到產品使用特性選擇水作為分散介質。

2.7.3 三七破壁飲片樣品粒徑分布檢查 取10批樣品，以純化水為分散介質，加入樣品池中，使遮光率為10%～20%，打開超聲分散裝置，待儀器讀數穩定后記錄粒徑分布D90值，結果分別為38.03、34.09、35.33、36.23、36.21、38.93、36.23、33.89、34.19、34.94 μm，平均值為35.81 μm。

2.8 含量測定

2.8.1 對照品溶液的制備 取人參皂苷Rg1對照品、三七皂苷R1對照品、人參皂苷Rb1對照品適量，精密稱定，加甲醇制成含人參皂苷Rg1 3 924.8 μg/mL、三七皂苷R1 1 206.5 μg/mL、人參皂苷Rb1 4 009.0 μg/mL的混合對照品溶液。

2.8.2 供試品溶液的制備 取樣品約0.6 g，精密稱定，精密加入甲醇50 mL，稱定質量，放置過夜，置80 ℃水浴上保持微沸2 h，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.8.3 色譜條件 按照文獻[9-12]方法設定色譜條件。色譜柱：太瑋科技JADE-PAK RS-C18Ⅱ色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-超純水(B)；梯度洗脫(0～12 min，19%乙腈；12～60 min，19%～36%乙腈)；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：203 nm；進樣量：10 μL。

2.8.4 系統適用性試驗 精密吸取供試品溶液、對照品溶液、空白甲醇各10 μL，注入液相色譜儀中，按“2.8.3”項下色譜條件進行分析，記錄色譜圖，見圖4。結果表明各物質的分離度、理論塔板數、靈敏度與拖尾因子均達到要求。另精密吸取對照品溶液10 μL，連續進樣5次，記錄色譜峰峰面積，各色譜峰峰面積RSD值均小于1.5%，結果表明本方法重復性良好。

注： 1. 三七皂苷R1；2.人參皂苷Rg1；3.人參皂苷Rb1

圖4空白溶劑(A)、對照品溶液(B)、供試品溶液(C)的高效液相色譜圖

2.8.5 線性關系考察 精密吸取“2.8.1”項下混合對照品溶液0.1、0.2、0.5、1、2、10 mL，置10 mL量瓶中，甲醇定容，搖勻。進樣量10 μL，按“2.8.3”項下色譜條件進行分析，測定峰面積，計算回歸曲線與方程。人參皂苷Rg1：A=3.634 9c-107.9，r=0.999 6；三七皂苷R1：A=3.269 4c-31.931，r=0.999 5；人參皂苷Rb1：A=2.537 4c-88.414，r=0.999 5。結果表明人參皂苷Rg1在0.392 5～392.5 μg，三七皂苷R1在0.120 7～120.7 μg，人參皂苷Rb1在0.400 9～400.9 μg范圍內與峰面積的線性關系良好。

2.8.6 10批樣品含量測定 取10批樣品，按“2.8.2”項下方法制備樣品溶液，并測定3種皂苷的含量(計算時已將對照品純度納入其中)，見表3。

3 討論

3.1 質量控制指標 10批樣品水分含量平均值為7.96%，總灰分含量平均值為3.08%，酸不溶灰分含量平均值為1.01%，未破壁細胞數平均值為60.9，粒徑平均值為35.81 μm，按不高于平均量的20%制定標準。甲醇浸出物平均值為23.68%，10批三七破壁飲片指紋圖譜相似度平均值為0.961，3種皂苷含量總和平均值為7.59%，按不低于平均量的80%制定標準。根據上述數據以及參考2015年版《中華人民共和國藥典》三七項下含量測定標準，將本品水分擬定為不得過9.5%，總灰分擬定為不得過4%，酸不溶性灰分擬定為不得過1.5%，浸出物含量擬定為不少于19.0%。擬定在100倍顯微鏡下檢視時，直徑大于100 μm且完整的細胞數不得超過100個。三七指紋圖譜鑒別樣品與對照藥材相似度不得小于0.8。粒徑不得大于45.0 μm。擬定人參皂苷Rg1、三七皂苷R1、人參皂苷Rb1含量之和不得低于6.0%。

表3 三七破壁飲片樣品含量測定結果

3.2 薄層色譜的耐用性考察 實驗中針對自制板和預制板的展開效果進行考察，結果顯示自制硅膠G板中人參皂苷Rg1和三七皂苷R1分離度不能達到鑒別要求，預制板中各斑點分離度良好，色譜辨識度高；對不同的展開距離和展開溫度條件進行考察，結果顯示展距為10 cm時各斑點不能實現很好分離，展距為17 cm時，各斑點分離度相對較好，易于辨識；展開溫度考察中，將薄層板分別置于6 ℃和室溫環境展開，結果表明在不同溫度下各斑點均可實現較好分離。

3.3 指紋圖譜方法學考察 在指紋圖譜方法學考察中，對供試品制備所用的提取方式、提取溶劑進行考察，比較超聲提取和回流提取法，并考察甲醇、無水乙醇、乙酸乙酯、水飽和正丁醇這4種溶劑的提取效率，最終確定以甲醇為溶劑，超聲(40 kHz，200 W)提取0.5 h。

中藥飲片經超微破壁粉碎后，有效成分充分暴露，成分釋放、溶出均顯著加快[13-14]，但目前破壁飲片的質量控制和評價體系并不完善，僅廣東省建立了《廣東省中藥破壁飲片質量標準研究規范(試行)》，這對于破壁飲片的發展和應用是遠遠不足的。本研究從性狀、顯微鑒別、薄層色譜、指紋圖譜、粒徑分布、浸出物以及指標成分的含量測定等多方面開展三七破壁飲片的質量分析，為有效制定三七破壁飲片質量標準提供實驗依據。