IL-10在大鼠蛛網膜下腔出血后早期腦損傷中的作用研究*

趙俠勇,趙君杰,宋錦寧△,金 濤

1.西安交通大學第一附屬醫院神經外科(西安 710061)；2.陜西省安康市中心醫院麻醉科 (安康 725000);3.陜西省安康市中心醫院神經外科 (安康 725000)

蛛網膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage，SAH)是神經外科常見的急危重癥，發病率大約為10/10萬，發病后1個月病死率達45%，30%的存活患者存在嚴重的神經功能障礙[1]。目前研究認為，SAH后早期腦損傷(Early brain injury，EBI)是影響SAH預后的關鍵因素[2]。EBI可能的病理機制包括細胞代謝改變、離子失衡、氧化應激、免疫炎癥等[3]，其中免疫炎癥在SAH后EBI中發揮重要作用[4]，但其具體機制尚未完全闡明。小膠質細胞是中樞神經系統的免疫細胞，是免疫炎癥的主要參與細胞，在SAH后的病理生理演變過程中扮演重要角色。SAH可導致小膠質細胞大量激活，并釋放多種細胞因子，參與SAH后神經元損傷。IL-10是一種重要的抗炎細胞因子，參與調控小膠質細胞的活化，但IL-10在SAH中的作用機制尚不完全清楚[5]。本研究擬通過血管穿刺法建立大鼠SAH模型，立體定向側腦室穿刺給予IL-10，利用Western blotting，免疫組化、HE染色及尼氏染色等分子生物學方法，研究SAH后神經元和小膠質細胞病理改變及炎癥相關因子TNF-α、IL-1β等的變化，以期闡明IL-10在SAH后參與EBI的相關作用機制。

材料與方法

1 實驗動物和主要試劑 選擇相同遺傳背景的健康成年雄性SD大鼠48只，體重300～350g，在標準環境飼養(溫度22℃，24h晝夜循環光照，食水自由)，隨機分為假手術組(12只)，SAH 1 d組(12只)，SAH 3 d組(12只)，SAH 1 d+IL10組(12只)、SAH 3 d+IL-10組(12只)。本實驗動物倫理經西安交通大學醫學部生物倫理委員會批準。IL-10的濃度為100 ng/L，建模后30 min內通過立體定向方法行側腦室注射5 μl。實驗材料包括：Iba-1抗體(日本Wako公司)，IL-10抗體、TNF-α、IL-1β(英國abcam公司)，IL-10蛋白因子(美國Novus公司)，兔SP免疫組化試劑盒(北京中杉金橋生物技術公司)，蛋白提取試劑盒(西安赫特)，HE染色試劑盒(武漢谷歌生物)、尼氏染色試劑盒(武漢谷歌生物)。

2 模型制作 SAH模型制作參考文獻中的大腦中動脈穿刺模型[6]，所有大鼠術前常規禁飲食6 h，用100 g/L的水合氯醛(3.5 ml/kg)腹腔注射進行麻醉。麻醉成功后將大鼠仰臥位固定于手術臺，頸部剃毛、消毒。頸部正中切開皮膚，鈍性分離，暴露左側頸總動脈主干及分叉，繼續向上分離暴露頸內動脈和頸外動脈。動脈夾臨時阻斷頸總動脈和頸內動脈，絲線結扎頸外動脈遠端并離斷，將帶有刻度的直徑約0.265 mm的魚線從頸外動脈殘端置入頸內動脈，去掉頸內動脈夾，從分叉處插入深度約20 mm，直至有突破感后再進線1～2 mm，維持15 s后將線抽出，結扎頸外動脈，去除所有動脈夾，縫合切口。

3 大鼠側腦室注射 造模后30 min內，大鼠俯臥位置于臺面，將頭部固定于腦立體定位儀上。頭頂皮膚剃毛，消毒，于正中做一長約1 cm切口，暴露前囟，以前囟為0點尋找進針點，其坐標[7]為：前囟后0.8 mm，中線旁1.5 mm。用磨鉆磨開顱骨，暴露硬腦膜，注射針垂直插入約3.5 mm，緩慢注射藥物，持續約10 min，完成后注射針繼續停留5 min，然后拔出注射針，骨蠟封閉骨窗，縫合頭皮切口。SAH組給予相同劑量的生理鹽水。

4 取材及組織病理學染色 SAH后1 d、3 d，麻醉大鼠，每組6只大鼠使用250 ml生理鹽水灌注取腦，分離皮層，置于液氮中保存。每組另6只大鼠使用生理鹽水250 ml灌注后并使用250 ml 40 g/L的多聚甲醛固定，取腦，并將腦組織放置在40 g/L的多聚甲醛中繼續固定48 h，然后置于自來水中24 h，80%乙醇浸泡。常規石蠟包埋、切片，片厚5 μm，60℃烤切片1 h，常規二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，標準步驟行HE染色、尼氏染色，常規脫水、透明、封片。

5 免疫組織化學檢測 常規烤片、脫蠟、梯度乙醇水化；3%的H2O2消除內源性過氧化物酶；0.01mol/L枸櫞酸緩沖液微波修復，自然冷卻至室溫；5%BSA封閉；滴加一抗IL-10(1∶400)、Iba-1(1∶400)；4 ℃過夜后，滴加二抗孵育，滴加SABC孵育，DAB顯色，自來水沖洗干凈；蘇木素復染；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片，鏡檢。免疫組織化學染色評分通過陽性細胞數評分與染色強度評分的乘積獲取[8]。陽性細胞數評分：無細胞染色計0分，1%～10%細胞數著色計1分，11%～50%細胞著色計2分，51%～80%細胞著色計3分，81%～100%細胞著色計4分。染色強度評分：無著色計0分，弱陽性計1分，中等強度陽性計2分，強陽性計3分。

6 Western blotting檢測 按蛋白質提取試劑盒的說明書提取大鼠皮層總蛋白，按1∶4比例加入Loading buffer后煮沸，置于-20℃。上樣，按每孔5 μl加入蛋白，電泳，轉膜，并在5%脫脂牛奶中封閉1 h，過夜孵育一抗IL-10(1∶1000)、TNFα(1∶1000)及IL-1β，然后TBST洗膜，室溫孵育二抗1 h，TBST洗膜，ECL顯影，利用凝膠成像系統觀察結果并拍照，Image J軟件進行分析。

7 行為學評估 大鼠行為學評估按照NSS評分法[9]，共18分：正常，0分；輕度損傷1～6分；中度損傷7～12分；重度損傷13～18分。包括運動、感覺、反射和平衡檢測，運動檢測：提起鼠尾巴，前肢屈曲1分，后肢屈曲1分，頭擺動的角度在縱軸超過10° 1分，將大鼠置于地面，正常行走0分，不能直線行走1分，圍繞癱瘓側轉圈2分，倒向癱瘓側3分；感覺檢測：淺感覺障礙1分，本體感覺障礙1分；平衡木檢測：穩定的姿勢保持平衡0分，抓握注平衡木1分，抱住平衡木且一只腳從平衡木掉下2分，抱住平衡木且兩只腳掉下來或在平衡木上旋轉(>60 s)3分，在平衡木上嘗試保持平衡但掉下來(>40 s)4分，在平衡木上嘗試保持平衡但掉下來(>20 s)5分，從平衡木上掉下來(<20 s)；反射缺陷及不正常運動：耳郭反射1分，角膜反射1分，驚訝反射1分，癲癇、肌陣攣、肌張力不全1分。

結 果

1 SAH后大體標本及組織形態學改變 通過穿刺頸內動脈制作大鼠SAH模型，與假手術組相比，SAH模型組可見蛛網膜下腔有廣泛的出血，尤其是在Wills環附近出血明顯。HE染色顯示，假手術組皮層神經元形態結構正常，細胞核呈藍色的球形，胞漿淡染。SAH 1 d后皮層結構疏松液化、結構紊亂，部分神經元腫脹，核固縮、深染、偏移(圖1)。

圖1 假手術組與SAH組腦組織大體觀及皮層HE染色(100×=146 μm;200×=73 μm)

2 SAH后IL-10的表達變化 Western blotting及免疫組織化學染色顯示IL-10表達于正常腦組織中，SAH 1 d及SAH 3 d IL-10表達未見統計學差異(P>0.05)，IL-10主要表達于細胞漿和細胞核，染色陽性的細胞形態多樣，呈大球形及分支形(圖2)。

3 IL-10改善SAH后神經功能缺損 神經功能評估在處死大鼠前操作。SAH后出現明顯的神經功能缺損，SAH 1 d組及SAH 3 d組神經功能缺損得分分別為(15.00±0.58)分和(12.00±0.73)分，表明是SAH 1 d組損傷程度為重度損傷，SAH 3 d組為中度損傷。與SAH組相比，IL-10顯著緩解了神經功能缺損，SAH 1 d+IL-10組和SAH 3 d+IL-10組神經功能評分分別為(8.83±0.79)分和(6.50±0.56)分，分別較SAH 1 d組和SAH 3 d組有顯著的降低(P<0.0001和P<0.0001)(圖3)。

4 IL-10改善SAH 1 d病理改變 與假手術組相比，SAH 1 d組皮層組織結構紊亂疏松，神經元尼氏體消失，給予IL-10后，與SAH 1 d組相比，皮層結構較為完整，神經元、尼氏體結構基本完整(圖4a)；與假手術組相比，SAH 1 d組結構紊亂疏松液化，細胞形態變化，核固縮深染，給予IL-10后，與SAH 1 d組相比，結構基本完整，細胞形態基本完整，核圓(圖4b)。

圖2SAH后IL-10表達情況(a:WB檢測IL-10表達及灰度值分析;b:皮層IL-10免疫組織化學染色，比例尺100倍=50 μm，200倍=20 μm;c:IL-10免疫組化評分;ns：無統計學差異)

5 IL-10減輕SAH后炎癥反應 Western blotting顯示，與假手術組相比，SAH 1 d、SAH 3 d組TNF-α、IL-1β表達明顯升高(P<0.0001)。與SAH 1 d、SAH 3 d組相比，SAH 1 d+IL-10組、SAH 3 d+IL-10組TNF-α、IL-1β比相應組表達明顯下降(圖5a、b、c)。與假手術組相比，SAH 1 d組小膠質細胞數量明顯增加、胞體變大、著色加深，小膠質細胞由假手術組的多分支、細分支、小胞體變為分支粗大、分支減少、胞體增大。與SAH 1 d組相比，SAH 1 d+IL-10組小膠質細胞明顯減小，分支多且細，著色減弱(圖6)。

討 論

本研究通過Western blotting及免疫組織化學檢測發現正常腦組織中存在IL-10的表達，SAH后1d和3d的IL-10表達變化不顯著；但在SAH后1h內，立體定向側腦室注射IL-10能明顯改善SAH后的神經功能缺損，且通過HE染色及尼氏染色證實IL-10顯著緩解了SAH后的腦組織及神經元損傷；進一步通過蛋白定量檢測發現IL-10能降低SAH后腦組織中TNF-α、IL-1β的表達，并減少小膠質細胞的激活。因此，本研究結果提示IL-10可能通過抑制小膠質細胞的炎癥反應從而緩解SAH后神經元損傷。

研究證實，針對SAH后腦血管痙攣的干預，即內皮素-1受體拮抗劑并不能顯著改善SAH預后[10]。目前認為EBI是導致SAH高致殘率和致死率的最主要原因，其中炎癥相關機制是導致SAH后EBI 的重要因素[11]。研究證實[4]，實驗性SAH后小膠質細胞明顯增多，TNF-α表達明顯升高，且與腦血流量的降低有一定相關性。Sozen等[12]研究發現，SAH后IL-1β表達明顯升高，認為IL-1β在SAH后EBI中發揮重要作用。本研究證實，SAH后小膠質細胞大量激活，炎癥因子TNF-α、IL-1β表達增高，佐證了SAH后炎癥反應的存在。IL-10是人體內重要的抗炎細胞因子，在急性腦損傷中發揮重要作用。有研究證實IL-10在大腦中動脈栓塞所致的缺血性卒中后表達上調[13]；而在IL-10缺陷的小鼠中，炎癥反應加劇，卒中后梗死面積增大[14]。創傷性顱腦損傷后，IL-10 mRNA含量迅速升高，IL-10蛋白表達也在損傷后2 h升高，而局部給予IL-10后可減少星形膠質細胞的激活和TNF-α的釋放，還能減少損傷體積和腦水腫[15]；還有研究證實腦出血后IL-10表達亦可上調，而腦出血相關臨床研究表明，血漿中高水平的IL-10與血腫擴張、再出血及不良預后有關[16]。

圖3 SAH后神經功能缺陷評分

圖4 IL-10緩解SAH后皮層損傷(a：尼氏染色，b：HE染色，比例尺=73 μm)

圖5 IL-10減少SAH后TNF-α、IL-1β的表達

圖6 IL-10減少SAH后小膠質細胞激活(比例尺=73 μm)

這些研究表明IL-10在急性腦損傷中的作用存在差異，在缺血性卒中和顱腦損傷中起到一定的保護作用，而在腦出血中提示不良預后。但相關研究表明SAH后基底動脈、腦脊液及大腦皮質中IL-10 mRNA表達卻未見明顯變化[17]，SAH相關臨床研究中亦發現血漿和腦脊液中IL-10蛋白水平無明顯變化[18]，這些與本文研究結果一致。但IL-10在不同原因損傷后表達差異的機制尚不清楚，有待進一步的研究。

IL-10是小膠質細胞替代激活的一種標記，參與抗炎作用，IL-10可能通過參與促進小膠質細胞的替代激活和誘導SOCS3從而緩解炎癥反應。但SAH損傷后，腦組織中內源性的IL-10表達未見明顯增高，可能未達到引起小膠質細胞替代激活的水平[19]，因此SAH后炎癥反應增強，主要表現在小膠質細胞的大量增生并釋放炎癥因子，如TNF-α、IL-1β等。SAH后早期經側腦室注射IL-10后，可見小膠質細胞活化減少，炎性因子釋放減少，且神經元損傷程度的減輕，炎癥反應表現明顯減弱，說明IL-10可能通過降低小膠質細胞活化、減少炎癥因子釋放等途徑，改善SAH后EBI導致的神經元損傷及神經功能障礙。

綜上所述，內源性IL-10在SAH后表達未見明顯變化，給予外源性IL-10后可緩解SAH引起的炎癥反應，并能減輕SAH后EBI導致的神經元損傷，改善神經功能障礙，這為SAH后神經損傷的抑制炎癥反應治療提供了理論依據，仍需通過進一步的實驗來證實炎癥機制在SAH后小膠質細胞活化與神經元損傷之間的作用機制。