TRIM21調控人結直腸癌細胞增殖分子機制研究*

柯東平，毛俊倩，劉 琪，郭甲民，馬龍安△

1.陜西省腫瘤醫院普外科 (西安710061)；2.陜西省楊凌示范區醫院普外科(楊凌712100)

結直腸癌(Colorectal cancer, CRC)具有高發病率、高病死率等特點。國際癌癥研究中心(IARC)在2018年9月發布的全球癌癥統計數據顯示，結直腸癌在所有癌癥中發病率排在第三位，癌癥相關病死率排名第二位。腫瘤細胞的增殖、生長、浸潤與許多基因的突變、異常表達密切相關，研究CRC中相關分子機制并找尋有效分子標記有利于CRC的及早診斷和治療。TRIM21是三元基序蛋白(Tripartite motif-containing protein, TRIM)家族成員，該家族一般含有RING結構域，具有E3泛素連接酶活性。人類的TRIM21位于第11號染色體上11p15.4區域，共475個氨基酸，包含四個結構域：RING結構域、B-box結構域、Coiled-coil結構域和PRYSPRY結構域。TRIM21最早在系統性紅斑狼瘡中被鑒定。后來的研究表明TRIM21與多種腫瘤的發生也密切相關[1-3]。研究發現，TRIM21在人腸癌中表達顯著降低，TRIM21缺失小鼠結腸癌的發生更明顯[5]。本研究將進一步探討TRIM21在結直腸癌中的作用機制，通過干擾結直腸癌細胞中的TRIM21表達，明確TRIM21對結直腸癌細胞增殖、凋亡及TGF-β1-Smad2/3信號通路活化的影響。

材料與方法

1 試劑與材料 RPMI-1640培養基(Gibco，31800-014)；胎牛血清(BI，04-001-1ACS)；MTT檢測試劑盒(萬類生物，WLA021a)；細胞凋亡檢測試劑盒(萬類生物，WLA001c)；Super M-MLV反轉錄酶(BioTeke，PR6502)；2×Power Taq PCR MasterMix(BioTeke，PR1702)；SYBR Green(Solarbio，SY1020)；TRIM21抗體(Bioss，bs-0635R)；TGF-β1抗體(萬類生物，WL01076R)；p-Smad2/3抗體(萬類生物，WL02305)；Smad2/3抗體(萬類生物，WL01520)CyclinD1抗體(萬類生物，WL01435a)；羊抗兔IgG-HRP(萬類生物，WLA023)；β-actin抗體(萬類生物，WL01845)。

2 實驗方法

2.1 細胞培養：人結直腸癌細胞HCT116細胞株用含有10 %胎牛血清的RPMI-1640培養基，在37 ℃、5 % CO2、飽和濕度條件下的細胞培養箱中培養。

2.2 TRIM21 siRNA轉染：HCT116細胞常規培養至細胞密度為70 %進行轉染。在室溫下混合無血清培養基稀釋的Lipofectamine 2000和siRNA干擾片段或陰性對照，靜置15 min。將上述溶液緩慢滴入培養的HCT116細胞中，不斷輕輕振蕩，置于37 ℃、5 % CO2培養箱中培養4 h后換液繼續培養。細胞共分三組：未轉染組、陰性對照(NC)組、TRIM21 siRNA轉染組。

2.3 MTT檢測細胞增殖：分別于轉染后24 h、48 h、72 h和96 h收集各組細胞，棄去培養基，每孔加入20 μl MTT染色液，置于37 ℃、5 % CO2培養箱中孵育4 h。4 h后小心吸去上清，加入150 μl DMSO，避光靜置10 min后用酶標儀測定570 nm處OD值。

2.4 Annexin V-FITC/PI法檢測細胞凋亡：轉染后48 h收集各組細胞，離心收集細胞沉淀，用PBS洗滌兩次，每管細胞用500 μl Binding Buffer重懸，依次加入5 μl Annexin V-FITC/PI和 10 μl PI混勻，室溫避光孵育15 min后上流式細胞儀檢測。

2.5 實時熒光定量PCR：分別于轉染后24 h、48 h收集細胞，加入TRIpure裂解液提取總RNA，Nano 2000測定RNA濃度。上述RNA樣本進行反轉錄得到對應的cDNA進行后續實驗。本實驗利用ERxicycler TM96熒光定量儀進行熒光定量分析，引物序列如下：TRIM21-F：5’- GCTCCAGGTGGCATTAGG-3’；TRIM21-R：5’-TGCACAAACTCTGCGTGA-3’；TGF-β1-F：5’-CCTGCCTCCGCTCCTAGT-3’；TGF-β1-R：5’-CATGGAAGATGGCAAATTAC-3’；Smad2-F：5’-CAGTGTTAGATACCCTCTTCGT-3’；Smad2-R：5’-TTGTTCATGTCCACAGACTAGATA-3’；Smad3-F：5’-AGAGGAGTGCTGGTGACTGGAT-3’；Smad3-R：5’-GGAAGGTGCTGAAGACAAGGAT-3’；Cyclin D1-F：5’-GAACACGGCTCACGCTTAC-3’；Cyclin D1-F：5’-CGATACACACAACATCCAGG-3’；β-actin-F：5’-CACTGTGCCCATCTACGAGG-3’；β-actin-R：5’-TAATGTCACGCACGATTTCC-3’。

2.6 Western blot：轉染后48 h收集細胞加入裂解液抽提總蛋白，BCA法對蛋白進行定量。取40 μg蛋白進行SDS-PAGE，電泳結束后轉膜、封閉；加入相應一抗4 ℃孵育過夜，二抗37 ℃孵育45 min，之后進行ECL底物顯色反應，暗室曝光，膠片用Gel-Pro-Analyzer軟件分析光密度值。

結 果

1 TRIM21 siRNA轉染效果驗證 在轉染后24 h和48 h分別通過實時熒光定量PCR和Western blot檢測HCT116細胞中的TRIM21在mRNA和蛋白水平上的表達，結果顯示，與陰性對照組相比，TRIM21 siRNA轉染組中TRIM21在mRNA水平和蛋白水平上的表達均顯著下降，差異具有統計學意義(圖1)。

圖1轉染后細胞中的TRIM21表達(A：Real-time PCR檢測TRIM21在mRNA水平上的相對表達量；B、C：Western blot檢測TRIM21在蛋白水平上的相對表達量與陰性對照組比，**P<0.01)

2 TRIM21 siRNA轉染后的細胞增殖 分別于轉染24 h、48 h、72 h和96 h后采用MTT檢測HCT116細胞的增殖情況，結果顯示(圖2)，24 h、48 h、72 h和96 h時TRIM21 siRNA轉染組細胞活力均高于陰性對照組，差異具有統計學意義(P<0.05)。Real-time PCR檢測細胞中增殖相關蛋白Cyclin D1表達，結果顯示(圖3)，與陰性對照組比，TRIM21 siRNA轉染組Cyclin D1的相對表達量明顯升高，差異具有統計學意義(P<0.01)。

3 TRIM21 siRNA轉染后的細胞凋亡 細胞轉染48 h后采用Annexin-V/PI法檢測細胞凋亡情況，結果顯示(圖4)，TRIM21 siRNA轉染組細胞凋亡比例為(6.27±0.05)%，顯著低于陰性對照組的(7.76±0.12)%，差異具有統計學意義(P<0.01)，見表1。

圖2MTT檢測轉染后的細胞增殖 (與陰性對照組比較，*P<0.05，**P<0.01)

圖3Cyclin D1的相對表達量 (A：Real-time PCR檢測Cyclin D1在mRNA水平上的相對表達量；B、C：Western blot檢測Cyclin D1在蛋白水平上的相對表達量;與陰性對照組比，**P<0.01)

表1 轉染后的細胞凋亡比例

注：與陰性對照組比，*P<0.01

4 TRIM21 siRNA轉染后細胞TGF-β1-Smad2/3通路活化情況 在轉染后48 h，采用實時熒光定量PCR和Western blot檢測TGF-β1、Smad2、Smad3的表達量，結果顯示(圖5)，與陰性對照組相比TRIM21 siRNA轉染組的TGF-β1在mRNA和蛋白水平的表達量均有所下降，差異具有統計學意義(P<0.01)；各組間Smad2/3在mRNA和蛋白水平的表達沒有差異，但采用Western blot檢測Smad2/3的磷酸化，結果顯示TRIM21 siRNA轉染組的p-Smad2/3水平低于陰性對照組，差異具有統計學意義(P<0.01)。

圖4 流式細胞術檢測轉染后的細胞凋亡(A：未轉染組；B：陰性對照組；C：TRIM21 siRNA轉染組)

圖5TRIM21 siRNA轉染后HCT116細胞TGF-β1-Smad2/3通路相關蛋白表達 (A：Real-time PCR檢測TGF-β1、Smad2和Smad3在mRNA水平上的相對表達量；B、C：Western blot檢測TGF-β1、Smad2/3、p-Smad2/3在蛋白水平上的相對表達量；與陰性對照組比，**P<0.01)

討 論

目前的研究已經證實，TRIM21在多種癌癥中存在異常表達，在不同的癌癥中扮演不同的角色。在CRC中，有研究曾報道了TRIM21與結腸炎相關結腸癌的發生[4]、CRC細胞順鉑敏感性[3]相關。本研究在此基礎上探討了TRIM21與CRC細胞增殖、凋亡的相關性，結果顯示在HCT116細胞中干擾TRIM21的表達使HCT116細胞增殖能力增強，同時凋亡細胞比例下降，說明TRIM21在CRC中可能發揮類似抑癌基因的作用，沉默TRIM21的表達使腫瘤細胞增殖能力進一步增強。此外，轉染TRIM21 siRNA的細胞中增殖相關蛋白Cyclin D1的表達也顯著升高。

TGF-β是一類多功能的細胞因子，通過與受體結合發揮功能。通常TGF-β1首先與TGF-βRⅡ結合，然后再與TGF-βRⅠ結合，形成的具有活性的復合物可以磷酸化Smads蛋白，如Samd1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8等，它們與co-Smad(Smad4)結合形成復合體，該復合體轉位至細胞核可以調控下游靶基因的轉錄[5]。TGF-β1-Smads通路是腫瘤中較為經典的信號通路，在不同類型、不同發展階段的腫瘤中功能不同，與腫瘤細胞的增殖、轉移能力密切相關。一方面，TGF-β1誘導周期依賴性激酶(Cycle dependent kinase, CDK)抑制劑p15的合成，阻止CDK和Cyclin的作用，抑制細胞增殖[6]；另一方面，在腫瘤的發展晚期，TGF-β1信號通路誘導上皮-間質轉化，促進腫瘤的侵襲和遷移[7]。在CRC發展期間，TGF-β1的功能也存在類似的變化[8]。

有文獻曾報道，TRIM21正調控TGF-β信號通路[9]。本研究主要探討TRIM21通過TGF-β1通路影響CRC增殖的機制。研究表明，在CRC早期，BAG-1通過抑制TGF-β1促進腫瘤細胞存活[10]；阿司匹林通過誘導TGF-β1抑制CRC細胞增殖[11]。本研究中，在HCT116細胞中轉染TRIM21 siRNA后，細胞中的TGF-β1表達量顯著下降，同時Smad2/3的磷酸化水平降低，說明干擾TRIM21的表達可以抑制TGF-β1—Smad2/3通路的活化，同時Western blot結果顯示細胞增殖相關蛋白Cyclin D1的表達水平也明顯下降，Cyclin D1是由p-Smad2/3調控的下游基因之一，提示TRIM21可能通過調控TGF-β1—Smad2/3通路的活化水平進而影響增殖相關蛋白的表達，從而影響CRC細胞增殖和凋亡，參與CRC發展進程。