疏肝通竅方對急性高眼壓大鼠視網膜神經損害的干預作用及對低氧誘導因子-1α表達的影響*

薛思源 趙 靜林成敏 莊 彥

（1.浙江省溫州市中西醫結合醫院，浙江 溫州 325000；2.溫州醫科大學附屬第一醫院，浙江溫州 325000）

青光眼是視力喪失的常見原因，為不可逆轉的致盲疾病，其發病與年齡、遺傳等多因素有關，眼壓升高與青光眼的發生發展密切升高，降低眼內壓可有效防治疾病［1-2]。眼內壓與房水的運輸密切相關，眼內壓過高或者持續時間過長，可造成視神經的損傷，甚至失明，高眼壓狀態下活性氧在視網膜蓄積，加重視網膜細胞損傷［3-4]。 低氧誘導因子-1α（HIF-1α）為缺氧環境下高度特異性核因子，可激活下游靶基因的表達，適應缺血缺氧環境，低氧環境時HIF-1α降解受到抑制，其蛋白水平急劇增加，引起系列細胞缺氧反應［5-6]。韓靜等研究發現，急性高眼壓大鼠視網膜HIF-1α表達水平降低，通過活血化瘀方干預后HIF-1α表達升高，發揮視網膜損傷保護作用［7]。中醫藥在青光眼性視神經損傷方面具有獨特優勢。疏肝通竅方為本院治療青光眼的臨床治療的經驗方，可顯著改善患者的視力和視野，具有較好的臨床療效，但其作用機制尚不明確。本研究通過建立急性高眼壓大鼠模型，研究疏肝通竅法對急性高眼壓大鼠視網膜神經損害的保護作用，并從氧化應激和HIF-1α表達水平方面探討其作用機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級Wistar大鼠60只，健康無眼疾，體質量（200±20） g，雌雄各半，鼠齡 8～10 周，北京維通利華實驗動物技術有限公司 ［SCXK-（京）2017-0061]。在（23±2）℃環境中采用12 h晝夜節律飼養，自由地飲水與進食，適應環境飼養1周進行試驗。實驗動物及條件符合《實驗動物管理條例》要求。

1.2 藥物與試劑 疏肝通竅方（組成：柴胡10 g，葛根10 g，當歸 10 g，郁金 10 g，石菖蒲 10 g，丹參 10 g，枸杞子10 g，防風10 g），由筆者所在醫院藥房提供，制成質量濃度1 g/mL的藥液備用；倍諾喜滴眼液，參天株式會社生產，批號180217。水合氯醛，上海化學試劑供應站生產；多聚甲酸，北京全世金生物科技有限公司生產；中性樹膠，中國上海戴洋儀器有限公司生產；TUNEL凋亡試劑盒和DAB顯色試劑盒，由碧云天生物科技有限公司生產；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）試劑盒，武漢華美生物工程有限公司生產；HIF-1α單抗，北京中同生物技術有限公司生產；引物合成，上海生物工程公司合成；Trizol提取試劑盒，由寶生物工程有限公司生產；二甲苯、乙醇等試劑均購于國藥集團化學試劑有限公司；實驗用水為超純水。

1.3 實驗儀器 手術顯微鏡和手術器械，由蘇州視覺醫療設備公司生產；LDZ-2型低速離心機，由北京京立離心機有限公司生產；ELx800酶標儀，由美國伯騰儀器有限公司生產；Tono-pen-avia筆式眼壓計，由美國Mentor公司生產；BX60顯微鏡，由日本Olympus Optical公司生產；數碼醫學圖像分析系統，由麥克奧迪實業集團有限公司生產；全自動免疫染片機，美國DAKO公司生產；RT-PCR擴增分析系統，由美國羅氏公司生產。

1.4 分組與造模 60只Wistar大鼠隨機分為對照組、模型組和干預組，每組20只。對照組正常飼養。將模型組和干預組采用前房灌注加壓法制備急性高眼壓大鼠模型，造模前測量眼壓排除眼壓異常大鼠，10%水合氯醛腹腔麻醉，俯臥位固定，氯霉素滴眼液沖左眼，倍諾喜滴眼液滴左眼表面麻醉，穿刺針頭于左眼平行于瞳孔緣迅速推進，孔眼朝下并位于瞳孔區中央并固定，生理鹽水瓶懸置于角膜頂點90 cm，打開輸液器，保持輸液器內液體不滴，90 min后瞳孔散大，眼前節輕度缺血，眼壓大于21 mmHg且高眼壓連續持續7 d以上為造模成功［8]，點氯霉素眼液預防感染。對照組僅做穿刺處理，不加壓。

1.5 給藥方法 造模后模型組、干預組給予4 mL疏肝通竅方藥液灌胃，對照組和模型組給予同等劑量的生理鹽水灌胃，每天1次，分別于第3日和第7日處死各組10只大鼠觀察。

1.6 標本采集與檢測 1）眼壓測定：鹽酸丙美卡因滴眼液表面麻醉后，Tono-pen-avia筆式眼壓計連續測量眼壓3次，取平均值。2）視網膜形態學：分別于第3日和第7日處死各組10只大鼠，取左眼，生理鹽水清洗后，10%甲醛固定液固定48 h后，二甲苯脫脂，酒精脫水，石蠟包埋，切片，HE染色，中性樹膠封片，光鏡下觀察視網膜各層結構。3）視網膜細胞凋亡：將視網膜切成0.5 mm3小塊，多聚甲醛磷酸固定，常規脫水、浸蠟、包埋、切片，蛋白酶K消化，PBS清洗，滴加TUNEL試劑盒反應液和復合液，DAB顯色，蘇木素復染并封片。顯微鏡下取5個視野觀察，正常神經節細胞核呈藍色，凋亡細胞核呈棕褐色，計算出細胞凋亡指數，凋亡指數=陽性細胞數/總細胞數×100%。 4）MDA、SOD 和GSH-Px測定：處死各組大鼠前，心臟取血，3 000 r/min離心20 min，取上清，采用ELISA測定血清MDA、SOD和GSH-Px水平，按照說明書操作。5）HIF-1α mRNA水平測定：分離完整視網膜，吸干表面水分，Trizol法提取視網膜總RNA，260 nm和280 nm波長檢測提取的RNA 純度，以 GAPDH（上游 5′-TTCTAGAGACAGCCG CATCT-3′，下游 5′-TGGTAACCAGGTGTCCGATA-3′）為內參，采用實時熒光定量PCR檢測HIF-1α mRNA水平 （上游 5′-CCATTACCTGCCTCTGA AACTCC-3′，下游 5′-CAGAAGGACTTGCTGGCTGATC-3′），40 個循環，預變性 95℃ 30 s，變性95℃ 10 s，退火60℃30 s，延伸72℃ 30 s，延伸72℃ 5 min，測定每組HIF-1α mRNA 的 Ct值，計算相對表達量。 6）HIF-1α蛋白測定：視網膜石蠟切片脫蠟至水化，檸檬酸抗原修復，超純水沖洗，50 μL 3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶，PBS緩沖溶液洗滌，50 μL山羊血清封閉15 min，傾去剩余溶液，滴加HIF-1α多克隆一抗稀釋液，4℃孵育過夜，PBS緩沖溶液洗滌，滴加二抗，室溫孵育2 h，PBS緩沖溶液沖洗3次，DAB顯色3 min，自來水充分沖洗，蘇木精復染，封片，HIF-1α蛋白表達量積分光密度（IOD）表示。

1.7 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，采用t檢驗比較組內和組間差異。計數資料以n（%）表示，應用χ2檢驗。不符合正態分布采用秩和檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠造模前后眼壓比較 見表1。造模前各組大鼠眼壓水平比較，差別不大（P＞0.05）。造模后模型組眼壓高于對照組同期，干預組眼壓則低于模型組同期（均P＜0.05）。

表1 各組大鼠眼壓水平比較（mmHg，±s）

表1 各組大鼠眼壓水平比較（mmHg，±s）

與對照組同期比較，*P＜0.05；與模型組同期比較，△P＜0.05。下同

組 別 第3日 第7日對照組 20.26±1.24 20.39±1.32 n 造模前20 18.61±1.23模型組 30.17±1.62* 29.53±1.46*20 18.25±0.96干預組 20 18.44±1.02 26.41±1.89*△ 23.72±1.52*△

2.2 各組大鼠視網膜形態學觀察 見圖1。對照組視網膜組織染色均勻，結構完整清晰，神經節細胞排列規則。模型組視網膜組織水腫，隨時間延長水腫加重，各層結構紊亂，神經節細胞排列疏松，數量減少，明顯萎縮變薄。干預組視網膜腫脹減輕，神經節細胞數量較模型組增加，視網膜萎縮程度減輕。

圖1 各組大鼠視網膜病理組織切片（HE染色，200倍）

2.3 各組大鼠視網膜細胞凋亡指數比較 見表2。造模前各組大鼠細胞凋亡指數比較，差別不大（P＞0.05）。造模后，模型組視網膜細胞凋亡指數高于對照組同期，干預組視網膜細胞凋亡指數低于模型組同期，但高于對照組同期（均P＜0.05）。

2.4 各組大鼠造模后第3日、第7日MDA、SOD和GSH-Px水平比較 見表3。模型組第3日、第7日血清MDA高于對照組，SOD和GSH-Px低于對照組。而干預組第3日、第7日血清MDA水平與模型組比較則降低，SOD和 GSH-Px則升高（P＜0.05）。

表2 各組大鼠視網膜細胞凋亡指數比較（%，±s）

表2 各組大鼠視網膜細胞凋亡指數比較（%，±s）

組 別 第3日 第7日對照組 4.26±1.32 4.52±1.41 n 造模前20 3.61±1.17模型組 53.17±6.27* 50.61±7.12*20 4.25±1.07干預組 20 4.19±1.14 32.08±7.13*△ 27.61±5.37*△

表3 各組大鼠血清MDA、SOD和GSH-Px水平比較（±s）

表3 各組大鼠血清MDA、SOD和GSH-Px水平比較（±s）

組 別 時 間 GSH-Px（ng/mL）對照組 第3日 183.14±21.37（n＝20） 第 7 日 185.27±22.38模型組 第3日 90.36±23.05*MDA（ng/mL） SOD（IU/mL）3.18±0.75 89.23±4.38 3.28±0.96 90.12±4.51 8.26±1.03* 67.12±5.23*（n＝20） 第 7 日 89.01±24.26*8.07±1.12* 65.37±5.42*干預組 第 3 日 6.67±1.32*△ 75.33±5.76*△ 129.64±25.06*△（n＝20） 第 7 日 4.29±1.37*△ 80.67±5.71*△ 136.75±24.12*△

2.5 各組大鼠造模后第3日、第7日HIF-1α mRNA水平比較 見表4。模型組第3日、第7日HIF-1α mRNA水平高于對照組，而干預組第3日、第7日HIF-1α mRNA水平則低于模型組同期，但高于對照組同期（均P＜0.05）。

表4 各組大鼠HIF-1α mRNA水平比較（±s）

表4 各組大鼠HIF-1α mRNA水平比較（±s）

組 別 第3日 第7日對照組 1.00±0.03 1.00±0.02 n 20模型組 2.97±0.12* 3.02±0.14*20干預組 20 1.61±0.09*△ 1.28±0.08*△

2.6 各組大鼠造模后第3日、第7日HIF-1α蛋白水平 見圖2和表5。模型組第3日、第7日視網膜可見HIF-1α棕黃色顆粒表達，模型組第3日、第7日HIF-1α蛋白IOD值高于對照組，干預組第3日、第7日HIF-1α弱于模型組，第3日、第7日HIF-1α蛋白IOD值低于模型組（均P＜0.05）。

圖2 各組視網膜HIF-1α蛋白免疫組化圖（DAB染色，400倍）

表5 各組大鼠視網膜HIF-1α蛋白水平比較（IOD，±s）

表5 各組大鼠視網膜HIF-1α蛋白水平比較（IOD，±s）

組 別 第3日 第7日對照組 0.25±0.04 0.27±0.03 n 20模型組 1.73±0.14* 1.69±0.11*20干預組 20 1.01±0.10*△ 0.81±0.07*△

3 討 論

青光眼視神經萎縮的發病機制與機械壓迫和血管缺血有關。眼壓作用于篩板直接壓迫視神經纖維，導致細胞代謝受損，缺血缺氧及視神經纖維失去周圍組織的保護，眼壓升高進一步加重視網膜神經調節障礙［9]。視神經損害主要表現為中心視野的損害，隨后出現管狀視野，最終導致失明，是由視網膜神經節細胞損傷變性和凋亡引起，高眼壓導致缺血缺氧，使視神經纖維軸漿流中斷［10]。高眼壓狀態下，視網膜細胞內自由基，MDA的體內表達水平是脂質過氧化作用的指標，GSH-Px是酶促抗氧化劑，與細胞內外各種酶結合，對機體各組織器官造成損傷，自由基則會影響細胞的正常結構和功能，導致視網膜細胞損傷受，SOD可通過催化超氧化物陰離子，發揮清除自由基的作用［11-12]。HIF-1α為氧依賴轉錄激活因子，缺氧條件下活性增強，表達增多，激活血管形成、細胞凋亡等靶基因，在缺血缺氧過程中發揮重要作用［13]。研究表明，眼壓升高后視網膜HIF-1α表達增加，視網膜損害與HIF-1α表達增多有關，輕度缺氧使HIF-1α表達增加，改善能量代謝和血管生成，為青光眼的發病機制及治療靶點研究熱點［14]。

中醫藥對青光眼視神經保護具有特有的優勢，《靈樞·大惑論》曰 “五臟六腑之精氣皆上注于目而為之精”，而“肝開竅于目”，眼與人體五臟六腑，尤其與肝的關系最為密切。中醫認為青光眼肝氣郁結，氣郁無助血前行，眼部氣血癖滯，脈道阻塞，治宜疏肝解郁、通奇明目。疏肝通竅方為本院治療青光眼的臨床治療的經驗方，方中柴胡疏肝解郁明目，對肝郁腎虛型外傷性視神經萎縮治療作用顯著，能有效提高患者視力；葛根和石菖蒲加強君藥疏肝理氣、通竅明目，葛根有緩解腦血管痙攣，舒張小動脈，改善眼底微循環，增加血液供應作用；石菖蒲《本草正義》指出其“使耳目聰明，九竅通利”，揮發油有血管擴張作用；當歸、郁金、丹參為佐藥，活血化癖，通絡明目，當歸活血通經、祛疲止痛，《審視瑤函》當歸活血飲，用于治療眼病胞輪振跳，抑制氧化反應和自由基反應等，促進腦血紅蛋白表達的恢復，具有保護視網膜的作用；郁金還可助君藥疏肝理氣，可引藥入血，增強疏肝止痛作用，有降血脂，抗真菌作用；丹參祛癖止痛、清心除煩、通血脈，對局部血液疲滯作用明顯，調節微循環血流速度，增強細胞的抗缺血、缺氧能力。枸杞子明目益精、益肝補腎，抗衰老、抗氧化損傷和抗細胞凋亡的作用；防風祛風解痙、梳理肝脾、調暢氣機，與活血化瘀藥物配伍有增效作用［15-18]。疏肝通竅方諸藥配伍，共奏疏肝解郁、通竅明目功效，可有效保護高眼壓視網膜組織。

本研究發現，干預組眼壓低于模型組，視網膜腫脹減輕，神經節細胞數量較模型組增加，視網膜萎縮程度減輕，視網膜細胞凋亡指數低于模型組，血清MDA水平降低，SOD和GSH-Px升高，干預組HIF-1α mRNA水平和蛋白IOD值低于模型組。這與疏肝通竅方中柴胡增強免疫功能，影響神經營養因子的表達，減少興奮性氨基酸；葛根擴張冠狀動脈，抗氧自由基及抗脂質過氧化，提高局部微血流量；石菖蒲減輕由興奮性氨基酸引起的神經毒性作用，當歸抑制神經炎癥反應，增強抗氧化能力；郁金改善血液循環，清除自由基；丹參改善微循環，調節血管內皮細胞；枸杞子抗氧化損傷，提高SOD活性；防風改善視網膜血供，擴血管改善微循環等密切相關［19-20]。

綜上所述，疏肝通竅方可保護急性高眼壓大鼠視網膜組織，減輕損害程度，其機制可能與抑制機體氧化應激和降低視網膜HIF-1α表達有關。