健脾益肺湯抑制NF-κB/STAT3信號通路改善哮喘模型大鼠氣道炎癥及氣道重塑作用研究*

張文斌 王 杰 王 瑋 魏恩垚 劉 煌 李 芹

（重慶市中醫院，重慶 400021）

全球約有3億人患有哮喘，氣道平滑肌細胞（ASMCs）被認為是氣道紊亂、狹窄和阻塞的主要效應細胞，ASMCs通過調節氣道炎癥和重塑反應參與哮喘的發病機制［1-2]。健脾益肺湯是臨床用于治療慢性阻塞性肺疾病（COPD）的中藥方劑，也有治療哮喘的作用，但其機制也未完全確定［3]。 核因子（NF）-kappaB（NF-κB）被認為是炎癥的關鍵調節器，激活NF-κB在哮喘氣道炎癥中起著重要的作用［4]。信號轉導及轉錄激活因子3（STAT3）是一種重要的轉錄因子，通過誘導細胞因子、黏附分子和趨化因子的表達，在調節炎癥反應中起著至關重要的作用［5]。STAT3通過改變Th2細胞募集和效應功能對哮喘的過敏性炎癥反應起著不可或缺的作用［6]。研究發現，健脾益肺湯能抑制許多相關的炎癥反應［7]。 然而，健脾益肺湯與 NF-κB/STAT3信號通路在哮喘中的關系仍是未知的。因此，本文通過探討健脾益肺湯能否抑制NF-κB/STAT3信號通路，為健脾益肺湯治療哮喘提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取30只8周齡SD大鼠（由華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心提供，許可證號：SYXK：2010-0057，動物合格證編號：0001507），雌雄各半，體質量 200～240 g，動物飼養在溫度 22～24℃、相對濕度為40%～70%的SPF環境中自由進食和飲水，適應性喂養1周后進行實驗。

1.2 試藥與儀器 1）試藥：健脾益肺湯（黃芪30 g，茯苓、炒白術、炒谷芽各15 g，人參、陳皮、桔梗各10 g，升麻、甘草6 g，砂仁5 g，購于重慶市中醫院中藥房，生藥3.0 g/mL）；卵蛋白（VOA）和氫氧化鋁凝膠（美國 Sigma公司）；γ 干擾素（IFN-γ）、白細胞介素（IL-4、IL-6 和IL-13）ELISA試劑盒 （上海酶聯生物科技有限公司）；鼠抗 NF-κB、p-NF-κB、STAT3 和 p-STAT3 單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；辣根過氧化物酶HRP標記親和純化山羊抗鼠IgG二抗和鼠抗GADPH單克隆抗體（武漢艾美捷科技有限公司）。2）儀器：霧化器WH-2000（廣東粵華公司）；HBS-1096B酶標儀（南京德鐵實驗設備有限公司）；ASP300S組織脫水機、EG1150組織包埋機、RM2255全自動輪轉切片機 （德國Leica公司）；BioDoc-It Imaging System凝膠成像儀 （美國UVP公司）；BIO-RAD垂直電泳儀（美國BIO-RAD公司）；ECLIPSE LV150L正立顯微顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.3 分組及造模 將大鼠按照隨機數字表法分為對照組、模型組和健脾益肺湯組，每組10只。采用OVA聯合氫氧化鋁凝膠多次激發致敏法造模。模型組和健脾益肺湯組在第1日和第8日肌注2%OVA 1 mL，腹腔注射氫氧化鋁凝膠（200 ng/mL）1 mL，第15日用霧化器泵入1%OVA溶液0.2 mL，每日1次，持續至第21日。對照組用0.9%氯化鈉注射液替代OVA和氫氧化鋁凝膠，其他操作與模型組和健脾益肺湯組相同。以大鼠出現腹肌收縮、呼吸急促、咳嗽等及血中嗜酸粒細胞百分比顯著增高確定模型成功［8]。

1.4 干預方法 健脾益肺湯生藥用800 mL水浸泡2 h，煮沸30 min，過濾。藥渣加600 mL水繼續煎煮20 min，過濾。合并兩次濾液，濃縮至約生藥含量3 g/mL的溶液。在造模結束后健脾益肺湯組以9 g/（kg·d）進行灌胃，每日1次，持續30 d。對照組和模型組給予3 mL/（kg·d）0.9%氯化鈉注射液灌胃，每日 1 次，持續30 d。末次給藥1 h后處死大鼠后進行相關檢測。

1.5 標本采集與檢測 1）大鼠肺組織切片觀察。用右肺上葉進行甲醛固定，經脫水、包埋，切成3 μm厚切片，進行蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察肺組織學變化。用Image-pro plus 6.0圖像分析軟件測量肺內氣管壁厚度和平滑肌厚度。2）肺泡灌洗及蛋白、IFN-γ、IL-4、IL-6和IL-13含量的測定。結扎右側主支氣管近端和氣管遠端，在氣管結扎下端用0.3 mL預冷0.9%氯化鈉注射液進行左肺灌洗，重復3次，回收支氣管肺泡灌洗液，離心取上清，根據BCA蛋白測定試劑盒說明書檢測支氣管肺泡灌洗液中總蛋白含量；根據ELISA試劑盒說明書檢測支氣管肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-4、IL-6和IL-13的含量。3）Western blotting法檢測NF-κB、p-NF-κB、STAT3和 p-STAT3蛋白表達水平。取右肺中葉進行研碎，進行蛋白質提取；調整蛋白濃度用SDS-PAGE凝膠進行電泳，每孔上樣量 20 μg，然后將蛋白轉膜到PVDF膜上，加入封閉液封閉1 h，孵育一 抗 ［NF-κB（1∶1 000）、p-NF-κB（1∶500）、STAT3（1∶500）、p-STAT3（1∶500）、GADPH（1∶4 000）]，4 ℃孵育過夜 12 h，孵育二抗［山羊抗鼠（1∶5 000）]2 h，用ECL顯色液顯色后進行曝光顯影，采集圖像，對免疫印跡條帶灰度值并進行分析。

1.6 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件。實驗結果以（±s），用方差分析進行分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

表1 各組大鼠氣管形態學變化比較（μm，±s）

表1 各組大鼠氣管形態學變化比較（μm，±s）

與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。 下同

組 別 n 氣管壁厚度 平滑肌厚度對照組 10 33.12±4.38 13.52±0.94模型組 10 70.64±5.09* 25.66±1.30*健脾益肺湯組 10 42.40±4.07*△ 17.63±1.08*△

圖1 各組大鼠氣管病理變化（HE染色，40倍）

2.1 各組大鼠氣管病理變化比較 見表1，圖1。與對照組比較，模型組大鼠氣管壁厚度和平滑肌厚度增加（P＜0.05）；給予健脾益肺湯干預后，大鼠氣管壁厚度和平滑肌厚度降低（P＜0.05）。

2.2 各組大鼠肺泡灌洗液中蛋白和IFN-γ表達比較見表2。與對照組比較，模型組大鼠肺泡灌洗液中蛋白增加，IFN-γ降低（P＜0.05）；給予健脾益肺湯干預后，大鼠泡灌洗液中蛋白降低，IFN-γ增加（P＜0.05）。

表2 各組大鼠肺泡灌洗液中蛋白和IFN-γ表達比較（±s）

表2 各組大鼠肺泡灌洗液中蛋白和IFN-γ表達比較（±s）

組 別 n 蛋白含量（mg/L） IFN-γ（pg/mL）對照組 10 104.03±10.16 147.54±11.89模型組 10 343.68±18.47* 96.94±10.35*健脾益肺湯組 10 168.60±17.55*△ 115.60±14.16*△

2.3 各組大鼠肺泡灌洗液中IL-4、IL-6和IL-13表達比較 見表3。與對照組比較，模型組大鼠肺泡灌洗液中 IL-4、IL-6和 IL-13 增加（P＜0.05）；給予健脾益肺湯干預后，大鼠泡灌洗液中IL-4、IL-6和IL-13降低（P＜0.05）。

表3 各組大鼠肺泡灌洗液中IL-4、IL-6和IL-13表達比較（pg/mL，±s）

表3 各組大鼠肺泡灌洗液中IL-4、IL-6和IL-13表達比較（pg/mL，±s）

組 別 n IL-4對照組 10 37.90±5.74模型組 10 106.61±9.13*健脾益肺湯組 10 75.86±6.49*△IL-6 IL-13 26.47±3.52 52.64±4.33 144.30±20.56*227.03±14.67*81.83±6.80*△ 94.31±8.65*△

2.4 各組大鼠肺組織中 NF-κB、p-NF-κB、STAT3 和p-STAT3表達比較 見表4，圖2。與對照組比較，模型組大鼠肺組織中 NF-κB、p-NF-κB、STAT3 和 p-STAT3增加（P＜0.05）；給予健脾益肺湯干預后，大鼠肺組織中 NF-κB、p-NF-κB、STAT3 和 p-STAT3 降低（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠肺組織中NF-κB、p-NF-κB、STAT3和p-STAT3表達條帶

3 討 論

吸入糖皮質激素是一種著名的治療哮喘的療法，然而，這種策略可以使骨密度降低［9]。因此，探索更有效的治療哮喘迫在眉睫。健脾益肺湯采用“君臣佐使”原則制定，以黃芪、茯苓為君，配以臣藥炒白術、炒谷芽、人參，并佐以陳皮、桔梗、升麻、甘草、砂仁等治療。研究發現，ASMCs更接近哮喘的上皮，這提示在哮喘中經歷了ASMCs遷移過程［2]。本研究結果顯示，健脾益肺湯能降低哮喘大鼠氣管壁厚度和平滑肌厚度，減少肺泡灌洗液中蛋白的分泌，可發揮治療哮喘的功效。有研究證明，健脾益肺湯能降低TNF-α和IL-8的水平來保護大鼠肺組織不受脂多糖的影響，但健脾益肺湯對肺組織的保護作用機制尚不清楚。

表4 各組大鼠肺組織中NF-κB、p-NF-κB、STAT3和p-STAT3 表達比較（±s）

表4 各組大鼠肺組織中NF-κB、p-NF-κB、STAT3和p-STAT3 表達比較（±s）

組 別 n NF-κB p-NF-κB STAT3 p-STAT3對照組 10模型組 10 0.39±0.04 0.27±0.03 0.53±0.06 0.19±0.01 1.24±0.09*0.70±0.06* 1.04±0.09* 0.66±0.07*健脾益肺湯組 100.62±0.05*△ 0.48±0.05*△ 0.62±0.03*△ 0.30±0.04*△

Th1/Th2失衡在哮喘的發生發展中起著重要作用［10]。Th2細胞是哮喘發病機制的關鍵T輔助細胞亞群。IL-4觸發Th2細胞的分化，導致其效應細胞因子IL-4、IL-6和IL-13的增強［11]。Th2細胞因子負責誘導過敏原特異性免疫球蛋白E（E-cadherin）的產生和炎癥介質的釋放［12]。Th1細胞可抑制Th2反應，IFN-γ是由Th1細胞分泌的重要細胞因子，其表達水平增加能抑制炎癥進展［13]。本研究結果顯示，健脾益肺湯能抑制IL-4、IL-6和IL-13的分泌，增加IFN-γ的水平，發揮治療哮喘的功能。

細胞因子包括TNF-α和IL-6等通過受體啟動信號級聯，導致轉錄因子的激活和靶基因的表達。NF-κB和STAT3都是潛在的細胞質轉錄因子或細胞因子刺激激活的因子，調節編碼免疫相關蛋白的基因轉錄。在人類中，激活NF-κB二聚體主要由Rel家族蛋白p50和p65子單元。NF-κB與啟動子中相應的κB位點結合以及靶基因的增強子，NF-κB發生磷酸化 （p-NF-κB）并激活通路。抑制NF-κB信號與調控Th1/Th2失衡有關［14]。 此外，NF-κB 信號失活抑制 ASMCs增殖和遷移［15]。通過抑制NF-κB減輕人間質細胞炎癥反應，但在哮喘中NF-κB信號仍然未知。因此，我們制備大鼠哮喘模型，探討NF-κB與哮喘的關系，結果顯示，健脾益肺湯能顯著抑制NF-κB和p-NF-κB的水平，證明健脾益肺湯能抑制NF-κB活性。二硫氨基甲酸肽吡咯烷（PDTC）是一種NF-κB抑制劑，可以抑制ASMCs的過度增殖，也間接證明了NF-κB在哮喘發病過程中的作用［16]。STAT3 和 NF-κB 一樣，參與激活免疫反應。在接收STAT3信號刺激后發生活化，生成磷酸化STAT3（p-STAT3）。研究表明，在小鼠哮喘模型中，過敏性炎癥需要STAT3。同時，STAT3抑制可以防止肺部炎癥和IL-13細胞因子的分泌［17]。本研究結果也表明健脾益肺湯能抑制STAT3活性。

綜上所述，健脾益肺湯通過抑制NF-κB/STAT3信號通路，減輕大鼠炎性反應，發揮哮喘氣道炎癥及氣道重塑改善作用，是哮喘治療的一種潛在候選藥物。