基于JAK2/STAT3信號通路探討姜黃素改善脂多糖誘導的小鼠急性肺損傷的作用研究*

石青青 蘇湘川 楊小平 劉丙進

（1.浙江省臺州市立醫院，浙江 臺州 318000；2.臺州職業技術學院，浙江 臺州 318000）

急性肺損傷是以肺泡-毛細血管通透性增加為特 征的一種呼吸道感染類疾病，可急性加重轉變為急性呼吸窘迫綜合征，急性肺損傷預后差，其病死率可達到40%［1]。在急性肺損傷疾病發展過程中，各種炎癥介質，包括腫瘤壞死因子 α（TNF-α）和白介素-8（IL-8），引起級聯反應導致中性粒細胞在肺部積聚［2-3]。因此，抑制炎癥介質的分泌可以改善急性肺損傷的病理進程。目前，臨床上對急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征的治療還以對癥支持治療為主，尚缺乏有效的治療手段和特效藥。姜黃素是姜黃的活性成分，從姜黃根莖中分離得到，具有廣泛的抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗腫瘤等多種藥理作用［4]。姜黃素在重癥急性胰腺炎大鼠模型中具有治療作用，同時在順鉑誘導的小鼠腎毒性中抑制了腎炎，提示姜黃素具有抗炎的作用［5-6]。Janus激酶2-信號轉導轉錄激活因子3（JAK2/STAT3）信號通路在細胞因子刺激下被激活，并將生物信號傳遞給靶細胞，參與細胞增殖、炎癥和纖維化的基因的調控［7]。研究顯示，JAK2/STAT3信號通路參與了胰腺炎的病理變化過程，但姜黃素改善急性肺損傷的作用是否通過JAK2/STAT3信號通路的調控尚不清楚［8]。因此，本研究小鼠腹腔注射脂多糖建立急性肺損傷模型，探討姜黃素通過JAK2/STAT3信號通路對急性肺損傷的改善作用，為急性肺損傷的治療提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取雄性6～9周齡昆明種小鼠30只，體質量 18～24 g，動物飼養在溫度 22～24℃、相對濕度為40%～70%、噪音≤50 dB的環境中自由進食和飲水，控制飼養環境晝夜循環（12 h/12 h），動物相關處置均符合 《中華人民共和國實驗動物管理條例》［9]要求，適應性喂養1周后進行實驗。

1.2 試藥與儀器 1）試藥：姜黃素和脂多糖（Sigma公司，美國）；昆明種小鼠（河北醫科大學實驗動物中心提供，中國）；戊巴比妥鈉（上海上藥新亞藥業有限公司，中國）；BCA蛋白測定試劑盒和Western blotting試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，中國）；TNF-α和IL-8 ELISA試劑盒 （上海酶聯生物科技有限公司，中國）；蛋白抽提試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，中國）；鼠抗 JAK2、p-JAK2、STAT3 和 p-STAT3 單克隆抗體（Santa Cruz公司，美國）；辣根過氧化物酶HRP標記親和純化山羊抗鼠IgG二抗和鼠抗GADPH單克隆抗體（武漢艾美捷科技有限公司，中國）；聚偏乙烯二氟膜（PVDF 膜）（Millipore公司，美國）；ECL 化學發光液（北京索萊寶科技有限公司，中國）；HBS-1096B酶標儀（南京德鐵實驗設備有限公司，中國）；HE染色試劑盒（中國國藥集團，中國）。2）儀器：組織脫水機、包埋機、全自動輪轉切片機等病理配套設備（Leica公司，德國）；凝膠成像儀（UVP公司，美國）；BIO-RAD垂直電泳儀（BIO-RAD公司，美國）；臺式冷凍離心機Sorvall STR ATOS（Heraeus 公司，德國）；光學顯微鏡（Nikon公司，日本）。

1.3 分組及給藥 對小鼠進行編號，分配選取的隨機數字，用隨機數字法將小鼠均分為3組，每組10只：對照組、模型組和姜黃素干預組。姜黃素溶液用生理鹽水配制成100 mg/mL的儲備液備用，姜黃素干預組連續灌胃給予姜黃素（100 mg/kg），對照組和模型組給予等量（2 mL）的生理鹽水，7 d，每日 1 次。

1.4 模型制備 末次給藥1 h后模型組和姜黃素腹腔注射給予脂多糖（10 mg/kg），對照組給予腹腔注射等量（0.2 mL）生理鹽水，6 h后麻醉處死大鼠進行相關檢測。

1.5 標本采集及檢測 1）大鼠肺組織切片觀察：每組取5只小鼠右肺上葉用10%甲醛固定，經脫水、包埋、將蠟塊切成3 μm厚切片、攤片、烤片后進行蘇木精-伊紅（HE）染色，最后用中性樹脂封片。用光學顯微鏡觀察肺組織學變化。2）肺濕重/干重（W/D）比：每組用5只小鼠分離左側左肺上葉，用濾紙吸棄肺組織表面水分，稱濕重（W），用恒溫干烤箱于110℃烘烤24 h，稱取余重即為干重（D）。計算肺組織W/D＝W（mg）/D（mg）。3）支氣管肺泡灌洗及蛋白、TNF-α和 IL-8含量的測定：每組用5只小鼠結扎右側主支氣管近端和氣管遠端，在氣管結扎下端用0.3 mL預冷生理鹽水進行左肺灌洗，重復3次，回收支氣管肺泡灌洗液，離心取上清，根據BCA蛋白測定試劑盒說明書檢測支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量的測定；用ELISA法檢測支氣管肺泡灌洗液中TNF-α和IL-8，按照ELISA試劑盒說明書進行TNF-α和IL-8的測定。4）Western Blotting法檢測JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表達水平：每組取5只小鼠右肺中葉，用研缽進行研碎，根據肺組織質量加入相應量蛋白抽提試劑，裂解2 h，離心取上清，進行蛋白定量；調整蛋白濃度，用SDS－PAGE）凝膠進行電泳，每孔上樣量20 μg，然后將蛋白轉膜到PVDF膜上，加入封閉液封閉1 h，孵育一抗［JAK2（1∶1 000）、p-JAK2 （1∶500）、STAT3 （1∶500）、p-STAT3（1∶500）、GADPH（1∶4 000）]，4 ℃孵育過夜，孵育二抗［山羊抗鼠（1∶5 000）]，用 ECL 顯色液顯色后進行曝光顯影，采集圖像，對免疫印跡條帶灰度值并進行分析。

1.6 統計學處理 應用SPSS19.0統計軟件。實驗結果以（±s）表示，用單因素方差分析進行分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組小鼠小鼠肺組織病理變化 見圖1。對照組小鼠肺組織切片未見明顯異常，肺泡結構完整，肺泡腔清晰未見水腫液，肺泡毛細血管無充血。模型組小鼠肺組織切片見肺泡壁部分增厚，細支氣管腔內有大量脫落炎細胞及滲出物，泡壁毛細血管充血嚴重。姜黃素干預組小鼠肺組織肺泡壁部分增厚，肺泡內炎癥細胞滲出及毛細血管出血較模型組輕。

2.2 各組小鼠肺組織W/D和支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量的比較 見表1。與對照組比較，模型組肺組織W/D和支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量增加，給予姜黃素干預后，肺組織W/D和支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

圖1 各組小鼠肺組織病理變化（HE染色，200倍）

2.3 各組小鼠支氣管肺泡灌洗液中TNF-α和IL-8水平的比較 見表2。與對照組比較，模型組支氣管肺泡灌洗液中TNF-α和IL-8含量增加，給予姜黃素干預后，支氣管肺泡灌洗液中TNF-α和IL-8含量降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表1 各組小鼠肺組織W/D和支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量的比較（±s）

表1 各組小鼠肺組織W/D和支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量的比較（±s）

與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05。 下同

組 別 n W/D 蛋白含量（mg/mL）對照組 5 2.35±0.08 107.03±11.89模型組 5 5.85±0.22* 359.68±24.08*姜黃素干預組 5 3.71±0.18*△ 155.64±18.43*△

2.4 各組小鼠肺組織中 JAK2、p-JAK2、STAT3和 p-STAT3蛋白表達的比較 見表3和圖2。與對照組比較，模型組和姜黃素干預組小鼠肺組織中JAK2和STAT3蛋白表達變化不顯著，差異無統計學意義（P＞0.05），模型組小鼠肺組織中p-JAK2和p-STAT3蛋白表達增加，給予姜黃素干預后，小鼠肺組織中p-JAK2和p-STAT3蛋白表達降低，差異具有統計學意義（P＜0.05）。

表2 各組小鼠支氣管肺泡灌洗液中TNF-α和IL-8水平的比較（ng/L，±s）

表2 各組小鼠支氣管肺泡灌洗液中TNF-α和IL-8水平的比較（ng/L，±s）

組 別 n TNF-α IL-8對照組 5 0.27±0.03 0.06±0.01模型組 5 1.57±0.10* 0.24±0.05*姜黃素干預組 5 0.54±0.08*△ 0.17±0.01*△

表3 各組小鼠肺組織中JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表達的比較（±s）

表3 各組小鼠肺組織中JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表達的比較（±s）

組 別 n JAK2 p-JAK2 STAT3 p-STAT3對照組 5模型組 5 0.85±0.15 0.21±0.02 0.70±0.06 0.12±0.01 0.81±0.08 0.54±0.06* 0.64±0.08 0.76±0.09*姜黃素干預組 50.88±0.14 0.41±0.04*△ 0.72±0.03 0.29±0.05*△

3 討 論

圖2 各組小鼠肺組織中JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表達的條帶

脂多糖是內毒素的主要成分，是革蘭陰性菌外膜的主要組成部分，具有一定的炎癥活性，被認為是誘導急性肺損傷發生的重要因素［10]。W/D和支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量是血管內皮通透性障礙所致肺水腫的指標，用于評估實驗性肺損傷［11]。在本研究中，模型組小鼠這兩個參數均較對照組有所增加，且病理結果顯示出現廣泛的組織學肺損傷，證明脂多糖誘導了急性肺損傷。姜黃素是從姜黃根中提取的多酚，已被證明可以減少炎癥反應，在再灌注引起的心肌缺血中起到顯著的心臟保護作用［12]。在本研究中，姜黃素預處理顯著降低了脂多糖誘導W/D和支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量，而且減輕肺組織學改變。這些結果提示姜黃素對內毒素誘導的急性肺損傷具有明顯的保護作用。

目前，急性肺損傷的發病機制尚不清楚。一般認為，細胞因子和炎癥介質的過量釋放在急性肺損傷中起關鍵作用［13]。炎癥介質TNF-α和IL-6等影響感染性疾病的結果，特別是引發全身炎癥反應，使相關疾病的死亡率增加［14]。在急性胰腺炎的研究中發現，血清中TNF-α和IL-6水平顯著增高，在給予姜黃素治療后，TNF-α和IL-6水平降低，本研究結果與之相一致，提示姜黃素可通過抑制炎性細胞因子減輕急性肺損傷［15]。

JAK2/STAT3信號通路是細胞因子和生長激素受體信號通路必不可少的通絡。越來越多的證據表明，JAK2/STAT3信號通路參與炎癥性疾病［16]。值得注意的是，細胞因子信號抑制因子3（SOCS3）通過抑制JAK2/STAT3信號通路的激活，參與了IL家族細胞因子對JAK2/STAT3信號通路的調控［17]。中性粒細胞和巨噬細胞中脂多糖可激活SOCS3，SOCS3在肺部的功能以前已經被研究過，SOCS蛋白在多個刺激下被激活，并抑制JAK2/STAT3信號通路［18]。在高糖處理的A549肺上皮細胞，SOCS3被激活，抑制JAK2/STAT3信號通路的磷酸化，表明SOCS3是JAK2/STAT3信號通路的負調控因子，參與了炎癥反應，在炎癥因子與JAK2/STAT3信號通路中起了橋梁作用［19]，激活JAK2/STAT3信號通路誘發IL-8在肺泡細胞過表達。值得注意的是，研究表明姜黃素作為JAK2/STAT3通路的抑制劑，在一些實驗模型和人類疾病中發揮了顯著的作用［20]。本研究發現，在小鼠急性肺損傷模型中，JAK2和STAT3的磷酸化明顯增加，而姜黃素預處理抑制了這兩種磷酸化，提示姜黃素通過干擾JAK2/STAT3通路激活，有效抑制了由急性肺損傷觸發的炎癥反應。但本研究沒有對SOCS3的表達水平進行檢測，筆者將在活性的研究中完善相關檢測。

綜上所述，本研究證實了姜黃素在小鼠急性肺損傷模型組發揮了保護作用，其作用機制可能與抑制JAK2/STAT3通路激活，減少炎癥介質分泌有關。因此，筆者認為姜黃素可能具有治療急性肺損傷的潛力。