金水六君煎及其拆方含藥血清對(duì)人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶誘導(dǎo)A549細(xì)胞黏液高分泌的影響*

柏正平劉 雨劉 芳 譚小寧譚電波鄧秀娟 李仲普 劉 俊 侯公瑾 譚光波△

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410006）

氣道黏液高分泌是慢性阻塞性肺疾病 （COPD）重要病理生理特征之一。黏液高分泌可導(dǎo)致氣道阻塞、氣流受限、通風(fēng)灌注錯(cuò)配及氣體交換減值與細(xì)菌定植，從而加速FEV1下降過(guò)程［1]。COPD屬中醫(yī)“喘證”范疇，我們認(rèn)為“痰飲”貫穿其始發(fā)生發(fā)展始終。現(xiàn)代研究認(rèn)為，黏蛋白MUC5AC、MUC5B是痰液分子物質(zhì)基礎(chǔ)，痰飲的實(shí)質(zhì)為氣道黏液高分泌［2]。金水六君煎出自《景岳全書(shū)》，主治咳嗽嘔惡，喘逆多痰，臨床上治療慢性支氣管炎咳嗽咯痰取得較好的效果，為進(jìn)一步闡明金水六君煎治療痰飲的作用機(jī)制，本研究以氣道黏液高分泌為切入點(diǎn)，觀察金水六君煎及其拆方含藥血清對(duì)體外人肺腺癌A549細(xì)胞黏蛋白MUC5AC、MUC5B表達(dá)的影響，探討金水六君煎治療氣道黏液高分泌的作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SD大鼠40只，鼠齡10～12周，體質(zhì)量（220±20）g，由湖南省斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)SYXK（湘）2016-0002。 飼養(yǎng)于溫度 22～26 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，通風(fēng)換氣8～12次/h的環(huán)境。

1.2 細(xì)胞株

人類(lèi)腺癌肺泡基底上皮細(xì)胞（A549），購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥物

金水六君煎組成：熟地黃15 g，當(dāng)歸6 g，半夏6 g，陳皮4.5 g，茯苓6 g，炙甘草3 g，生姜5～7片。 金水六君煎拆方養(yǎng)陰組：熟地黃15 g，當(dāng)歸6 g。金水六君煎拆方化痰組：半夏6 g，陳皮4.5 g，茯苓6 g，炙甘草3 g。中藥飲片購(gòu)自湖南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院。

1.4 試劑與儀器

1）試劑：人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶（HNE）（英國(guó)Abcam，ab91099）；DMEM（HyClone，批號(hào) SH30243.01）；胎牛血清（Pansera ES，美國(guó)）；0.25%胰酶消化液（Gibco，美國(guó)）；1%青霉素和鏈霉素 （上海慧穎生物技術(shù)有限公司，SV30010）；MUC5AC ELISA 試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，Y15037320）；MUC5B ELISA試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，Y10037321）；小鼠MUC5AC、MUC5B 單克隆抗體（SantaCruz）；Tris、APS、SDS、TEMED、Tween-20、丙烯酰胺、甘氨酸（美國(guó) Sigma）；HRP 羊抗鼠 IgG（美國(guó) Proteintech），RIPA 裂解液/蛋白酶抑制劑，SuperECL Plus超敏發(fā)光液（美國(guó)Thermo pierce）；上樣緩沖液6X（上海碧云天）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京康為世紀(jì)）；Trizol（Invitrogen）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、UltraSYBR Mixture（北京康為世紀(jì)）；SYBRGREEN I核酸染料（北京普博欣生物）。2）儀器：細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher）；倒置顯微鏡 （北京同舟同德，DSZ2000）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（DiaSorin，MAX3000）；臺(tái)式冷凍離心機(jī)（上海新力，Neofuge23R）；搖床（江蘇其林貝爾，TS-92）；電泳儀（美國(guó) Biorad，164-5050）；轉(zhuǎn)膜儀（北京六一，DYCZ-40A）；全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)（英國(guó) Syngene G 公司）； 熒光 PCR 板（Thermo，SPL0960）；熒光定量 RCP 儀（Thermo，PIKO REAL 96）。

1.5 含藥血清制備

按照隨機(jī)數(shù)字表法將40只雄性SD大鼠平均分為空白組、金水六君煎組、養(yǎng)陰組、化痰組，每組10只。大鼠給藥劑量參考人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比例表，大鼠的等效劑量相當(dāng)于人的6.3倍，每只動(dòng)物每千克體質(zhì)量給藥量按臨床人（70 kg）的等效量，并擴(kuò)大5倍。按照10 mL/kg灌胃量，大鼠每天灌胃2次，兩次間隔時(shí)間為2 h，連續(xù)3 d，空白對(duì)照組灌胃等體積生理鹽水。末次給藥1 h后無(wú)菌條件下腹主動(dòng)脈采血，3 000 r/min離心5 min，取血清，同組血清相混合，置于56℃水浴滅活補(bǔ)體30 min，過(guò)濾器（0.22 μm孔徑）過(guò)濾除菌，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 細(xì)胞培養(yǎng)

人類(lèi)腺癌肺泡基底上皮細(xì)胞 （A549）培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2日換液1次，按1∶3 比例傳代。

1.7 細(xì)胞分組及干預(yù)

對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以每孔1×105/mL密度接種于6孔板，加入DMEM培養(yǎng)基+10%FBS，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h至細(xì)胞貼壁。去原培養(yǎng)基，加入無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱饑餓培養(yǎng)24 h。去原培養(yǎng)基，以孔為單位，分為正常對(duì)照組（加入20%空白組大鼠血清）、模型組（加入20%空白組大鼠血清和終濃度為25 nmol/L HNE）、金水六君煎組（加入20%金水六君煎含藥血清和終濃度為25 nmol/L HNE）、養(yǎng)陰組（加入20%養(yǎng)陰組含藥血清和終濃度為25 nmol/L HNE）、化痰組（加入20%化痰組含藥血清和終濃度為25 nmol/L HNE），每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37℃，5%CO2培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

1.8 觀察項(xiàng)目

1.8.1 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞稀釋吹打成濃度為5×103/mL的單細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔細(xì)胞懸液量為100 μL，設(shè)立空白對(duì)照孔（加培養(yǎng)基100 μL），實(shí)驗(yàn)分空白組、模型組、金水六君煎組、養(yǎng)陰組、化痰組，每組復(fù)孔數(shù)為3，各組細(xì)胞均在37℃，5%CO2環(huán)境下共同孵育3 d，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，每孔加CCK-8溶液10 μL，溫育1 h后，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處各孔的吸光度（OD值）。

1.8.2 Realtime-PCR檢測(cè)基因表達(dá) 采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，1%變性瓊脂糖凝膠鑒定，紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度及純度，根據(jù) HiFiScript cDNA Synthesis Kit進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。在NCBI上搜索目的基因的序列，運(yùn)用primer5軟件設(shè)計(jì)引物，引物序列：actin：上游5′-ACCCTGAAGTACCCCATCGAG-3′，下游 5′-AGC ACA GCCTGGATAGCAAC-3′，引物長(zhǎng)度 224 bp；MUC5AC：上游 5′-ACCAGCATCTTCATCAACCT-3′， 下游 5′-TT CCCAAACTCCAGCACGTC-3′， 引物長(zhǎng)度 137 bp；MUC5B： 上游 5′-GCCCACATCTCCACCTATGAT-3′，下游 5′-GCAGTTCTCGTTGTCCGTCA-3′， 引物長(zhǎng)度141 bp。DEPC水溶解引物至終濃度10 pmol/μL。按照UltraSYBRMixture合成試劑盒建立30 μL實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系，熒光定量PCR儀設(shè)定如下：95℃5 s變性，60℃ 60 s退火、延伸，循環(huán)40次。以各組β-actin作為內(nèi)參，應(yīng)用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.8.3 Western blotting檢測(cè)蛋白 采用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白，按照BCA蛋白定量試劑盒操作，測(cè)定蛋白濃度。樣品孔加入20 μL已變性蛋白，SDS-聚丙烯酞胺凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜，脫脂奶粉封閉，小鼠MUC5AC、MUC5B單克隆抗體（1∶200），β-actin（1∶5 000），4 ℃冰箱孵育過(guò)夜；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的HRP羊抗鼠IgG（1∶5 000），室溫下孵育1.5 h，膜充分洗滌后用ECL化學(xué)發(fā)光液膜孵育3 min，暗室曝光沖印，BioRad成像系統(tǒng)分析電泳條帶，QuantityOne圖像分析軟件計(jì)算2個(gè)基因與βactin比值。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組A549細(xì)胞活性的比較

見(jiàn)表1。與空白組比較，模型組細(xì)胞活性降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，金水六君煎組，養(yǎng)陰組、化痰組對(duì)細(xì)胞活性無(wú)明顯變化（P＞0.05）。

表1 各組A549細(xì)胞活性比較（±s）

表1 各組A549細(xì)胞活性比較（±s）

組 別 n空白組 3模型組 3金水六君煎組 3 450 nm吸光光度值（OD值）0.85±0.10 0.71±0.09 0.75±0.12養(yǎng)陰組 3 0.84±0.10化痰組 3 0.78±0.04

2.2 各組A549細(xì)胞MUC5AC mRNA、MUC5B mRNA表達(dá)的比較

見(jiàn)表2。與空白組比較，模型組黏蛋白MUC5AC mRNA、MUC5B mRNA 表達(dá)明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，金水六君煎組及養(yǎng)陰組MUC5AC mRNA、MUC5B mRNA表達(dá)明顯降低（P＜0.05），化痰組較模型組呈減少趨勢(shì)，但差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 各組A549細(xì)胞黏蛋白MUC5AC mRNA、MUC5B mRNA表達(dá)比較（±s）

表2 各組A549細(xì)胞黏蛋白MUC5AC mRNA、MUC5B mRNA表達(dá)比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與空白組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同

組 別 n MUC5AC mRNA MUC5B mRNA空白組 3 1.26±0.24 0.74±0.27模型組 3 2.33±0.48△ 1.70±0.36△金水六君煎組 3 1.39±0.32* 0.87±0.23*養(yǎng)陰組 3 1.47±0.11* 0.76±0.08*化痰組 3 2.19±0.39△ 1.27±0.08△

2.3 各組A549細(xì)胞MUC5AC、MUC5B蛋白表達(dá)的比較

見(jiàn)表3，圖1。與空白組比較，模型組 MUC5AC、MUC5B蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.01）。與模型組比較，金水六君煎MUC5AC、MUC5B蛋白表達(dá)降低 （P＜0.05或P＜0.01）；化痰組MUC5AC、MUC5B蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.01）；養(yǎng)陰組較模型組 MUC5AC、MUC5B 蛋白表達(dá)減少，但差異無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組A549細(xì)胞黏蛋白MUC5AC、MUC5B蛋白表達(dá)比較（±s）

表3 各組A549細(xì)胞黏蛋白MUC5AC、MUC5B蛋白表達(dá)比較（±s）

組 別 n MUC5AC MUC5B空白組 3 0.27±0.06 0.32±0.04模型組 3 0.52±0.06△△ 0.48±0.05△△金水六君煎組 3 0.35±0.06* 0.25±0.05**養(yǎng)陰組 3 0.44±0.06△ 0.42±0.05△化痰組 3 0.29±0.05** 0.20±0.05△**

圖1 各組A549細(xì)胞黏蛋白MUC5AC、MUC5B蛋白電泳條帶

3 討 論

氣道黏液高分泌是COPD重要病理生理特征，在成人呼吸道分泌的黏蛋白中，MUC5AC和MUC5B是主要分泌物，氣道黏液高分泌過(guò)程中MUC5AC和MUC5B表達(dá)明顯升高。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為痰飲貫穿COPD始終，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)與中醫(yī)學(xué)進(jìn)行較為全面的研究，認(rèn)為“氣道黏液高分泌”就是中醫(yī)學(xué)“痰飲”［3-4]。金水六君煎出自《景岳全書(shū)》，主治肺腎虛寒，水泛為痰，及年邁陰虛、氣血不足外受風(fēng)寒，咳嗽嘔惡多痰，喘急等證，臨床上治療老年慢性咳嗽咯痰具有顯著的效果。其組方由二陳湯 （半夏、陳皮、茯苓、甘草）及貞元飲（熟地黃、當(dāng)歸、炙甘草）組合而成，其中二陳湯為治一切痰飲之通劑，貞元飲補(bǔ)精血固下元，使腎水不上泛為痰。全方利濕化痰與滋腎養(yǎng)陰并行，濕痰無(wú)以生成，肺無(wú)濁痰則清寧肅降，肺腎之陰得復(fù)則氣能歸根，而咳喘諸癥得除［5-6]。藥效學(xué)研究能促進(jìn)纖毛運(yùn)動(dòng)和排痰量［7]。

目前國(guó)內(nèi)外用于構(gòu)建體外黏液高分泌的細(xì)胞模型主要有人氣道上皮細(xì)胞的黏液上皮細(xì)胞癌細(xì)胞株NCI-H292、肺腺癌細(xì)胞株A549、人支氣管上皮細(xì)胞16HBE。HNE和LPS是黏液高分泌的主要誘導(dǎo)劑［8-12]。HNE是目前公認(rèn)最強(qiáng)促黏液分泌劑，可同時(shí)誘導(dǎo)MUC5AC和MUC5B表達(dá)增高。蘭箭等研究發(fā)現(xiàn)，A549同時(shí)表達(dá)MUC5AC和MUC5B，且對(duì)人HNE的刺激誘導(dǎo)呈良好的量效關(guān)系［13]。高健美、楊娟等［11，14]采用50 nmol/L HNE誘導(dǎo)A549細(xì)胞黏液高分泌，均發(fā)現(xiàn)MUC5AC表達(dá)明顯升高。因此，本研究采用人中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶誘導(dǎo)A549細(xì)胞建立體外氣道黏液高分泌細(xì)胞模型。

本研究采用終濃度為25 nmol/L HNE誘導(dǎo)A549細(xì)胞，同時(shí)用正常大鼠及含藥血清干預(yù)24 h，發(fā)現(xiàn)各組細(xì)胞活性無(wú)明顯差異，模型組MUC5AC、MUC5B基因與蛋白表達(dá)較正常組均顯著升高，提示HNE對(duì)細(xì)胞增殖及活性無(wú)影響，HNE誘導(dǎo)可成功建立黏液高分泌細(xì)胞模型。與模型組比較，金水六君煎組及養(yǎng)陰組能顯著降低MUC5AC mRNA、MUC5B mRNA表達(dá)，金水六君煎組及化痰組能顯著降低MUC5AC、MUC5B蛋白表達(dá)，提示金水六君煎在轉(zhuǎn)錄水平及翻譯水平抑制黏蛋白MUC5AC、MUC5B基因表達(dá)，金水六君煎中養(yǎng)陰成分主要通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平抑制MUC基因表達(dá)，金水六君煎中化痰成分主要通過(guò)翻譯水平抑制MUC蛋白表達(dá)。周建龍等研究發(fā)現(xiàn)高濃度半夏提取物能通過(guò)抑制MUC5AC表達(dá)，上調(diào)AQP5表達(dá)抑制大鼠氣道黏液高分泌狀態(tài)，半夏燥濕化痰可能是金水六君煎治療氣道黏液高分泌主要藥效成分［15]。

綜上，金水六君煎及其拆方含藥血清可通過(guò)抑制黏蛋白基因及蛋白表達(dá)改善HNE誘導(dǎo)的細(xì)胞黏液高分泌，為臨床金水六君煎治療COPD高黏液分泌提供理論基礎(chǔ)與臨床指導(dǎo)。但金水六君煎及其拆方調(diào)控黏蛋白基因與蛋白表達(dá)的信號(hào)通路及作用機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。