FBXO22對乳腺癌細胞侵襲遷移能力的影響

方虹舒，張 薇

(重慶市第四人民醫院檢驗科，重慶 400014)

有研究表明,絕大多數的乳腺癌相關死亡是由于發生遠端轉移而不是原發腫瘤[1]。惡性乳腺癌的進展是一個高度復雜的過程,主要涉及腫瘤生長和侵襲后轉移性傳播到遠端的器官[2]。為提高臨床療效，迫切需要確定控制乳腺癌轉移進展的決定性分子因素和抗轉移治療的新靶點。泛素-蛋白酶體系統通過三步級聯酶調控泛素依賴性蛋白水解，涉及泛素激活酶(E1)、泛素偶聯酶(E2)和泛素連接酶(E3)[3]。真核生物E3中最大的家族是SKP1-Cullin-F-box蛋白(SCF)E3連接酶復合體[4]。其中F-box蛋白家族是其主要部分，通過蛋白-蛋白互作基序與底物結合，確定底物特異性[5-6]。迄今為止，絕大多數F-box蛋白的生物學功能和生理底物仍未明確。現有研究表明，FBXO22通過介導泛素依賴性降解腫瘤抑制因子——KLF4，從而促進肝細胞癌的進展[7]。最新研究表明，FBXO22基因沉默后能降低結腸癌細胞的侵襲遷移能力。然而，FBXO22對乳腺癌細胞的侵襲遷移能力及其相關分子機制尚不清楚。本研究探究了FBXO22基因沉默后對乳腺癌細胞侵襲遷移能力的影響，并初步探究了其相關分子機制。

1 材料與方法

1.1材料 乳腺癌MDA-MB-231細胞株由重慶醫科大學基礎醫學院提供，杜氏改良Eagle培養基(DMEM)及胎牛血清購自Hylcone公司(美國)，胰酶及Transwell小室購自Millipore公司(美國)，磷酸鹽緩沖液(PBS)購自武漢博士德公司，小干擾RNA(siRNA)-FBXO22(FBXO22-siRNA組)及對照siRNA(Control-siRNA組)購自上海吉瑪公司，Lipofectamine 2000轉染試劑購自Thermo Fisher公司(美國)，FBXO22、E-cadherin、波形蛋白(Vimentin)、基質金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9購自CST公司(美國)。

1.2方法

1.2.1細胞培養 乳腺癌MDA-MB-231細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM中，置于5%二氧化碳(CO2)、37 ℃恒溫培養箱中培養。

1.2.2細胞轉染 轉染前取對數生長期的MDA-MB-231細胞接種于6孔板中，并于5% CO2、37 ℃恒溫培養箱中培養至細胞密度為60%～70%。按Lipofectamine 2000轉染試劑說明書進行轉染，參照說明書分別用培養基將siRNA(FBXO22-siRNA組)和Lipofectamine 2000試劑(Control-siRNA組)稀釋后在室溫下孵育5 min，然后將二者輕輕混合，在室溫下孵育20 min。將復合物加入到每個包含細胞和培養基的孔中。37℃、CO2培養箱孵育24～96 h。采用蛋白質印跡(Western blot)法檢測轉染效率。并在后續實驗中將細胞分為只有試劑對照的對照組(Control)，轉染對照，siRNA的Control-siRNA組以及轉染FBXO22的FBXO22-siRNA組。

1.2.3細胞劃痕實驗 將轉染后的MDA-MB-231細胞用胰酶消化，以5×105個/孔接種到6孔板中。24 h后用槍頭進行劃線，用PBS清洗3次，去除劃下的細胞后加入無血清培養基。放入37 ℃、CO2培養箱中共培養48 h后取出拍照。

1.2.4Transwell遷移實驗 將轉染后的MDA-MB-231細胞用胰酶消化，用DMEM制成單細胞懸液，以5×104個/孔接種于Transwell上室內。Transwell下室內加入含10%胎牛血清的DMEM。37℃、CO2培養箱中共培養20 h后取出Transwell小室，棄上室培養液，用棉簽擦去上室內未遷移的細胞。然后用95%乙醇固定膜下表面細胞，取下Transwell小室膜，經結晶紫染色后置于載玻片上封片。在光鏡(100×)下觀察遷移細胞數，隨機選取5個視野計數，計算平均遷移細胞數。

1.2.5Western blot 收集轉染48 h后的MDA-MB-231細胞，提取總蛋白并采用BCA法測定蛋白濃度。在恒壓條件下采用十二烷基硫酸鈉-聚丙稀酰胺凝膠電泳法電泳分離蛋白，然后在恒流條件下將蛋白轉印到PVDF 膜上，用10%脫脂奶粉封閉4 h后加入一抗4 ℃孵育過夜，用TBST洗滌3次后加入二抗37 ℃孵育2 h，用TBST洗滌3次后采用ECL 化學發光法顯影，采集圖像。

2 結 果

2.1細胞轉染效率檢測 FBXO22-siRNA組MDA-MB-231細胞中FBXO22蛋白表達水平明顯低于Control-siRNA組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。表明FBXO22-siRNA下調了乳腺癌MDA-MB-231細胞中FBXO22的蛋白表達水平。

注：與Control-siRNA組比較，*P<0.05

圖1轉染后乳腺癌細胞中FBXO22表達水平

2.2下調FBXO22蛋白表達水平對乳腺癌細胞侵襲能力的影響 FBXO22-siRNA組MDA-MB-231細胞中發生侵襲轉移者明顯低于Control-siRNA組及對照組(Control)。見圖2。表明FBXO22蛋白表達下調后乳腺癌細胞MDA-MB-231侵襲能力明顯減弱。

圖2 下調FBXO22對乳腺癌細胞侵襲能力的影響

2.3下調FBXO22蛋白表達水平對乳腺癌細胞遷移能力的影響 與Control-siRNA組及對照組比較，FBXO22-siRNA組MDA-MB-231細胞中穿過transwell小室膜的數目明顯減少，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖3。表明FBXO22蛋白表達下調后乳腺癌細胞MDA-MB-231的遷移能力明顯降低。

注：A表示對照組(Control)；B表示Control-siRNA組；C表示FBXO22-siRNA組；與Control-siRNA組及對照組比較，*P<0.05

圖3下調FBXO22對乳腺癌細胞遷移能力的影響

2.4下調FBXO22蛋白表達水平對乳腺癌細胞侵襲遷移相關蛋白水平的影響 FBXO22蛋白表達水平下調后MDA-MB-231細胞中E-cadherin表達水平升高， Vimentin表達水平降低，與細胞侵襲遷移能力相關的MMP-2、MMP-9蛋白水平下降，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖4。表明下調FBXO22基因能引起上皮細胞-間充質轉化(EMT)進程相關蛋白——E-cadherin和Vimentin表達發生改變，以及侵襲遷移相關蛋白——MMP-2和MMP-9水平下降。

注：*P<0.05

圖4下調FBXO22對乳腺癌細胞侵襲遷移相關蛋白的影響

3 討 論

F-box蛋白是介導磷酸化依賴性泛素的SCF泛素蛋白連接酶復合物的4個亞基之一[8]。F-box蛋白分為3類:含有WD-40結構域的Fbws，含有富含亮氨酸重復序列的Fbls，以及含有不同蛋白-蛋白相互作用模塊或無識別基序的Fbxs[9]。FBXO22蛋白屬Fbxs類，作為腫瘤蛋白p53的轉錄靶點，被認為參與了p53誘導后特異性蛋白的降解[10]。FBXO22能通過調控p21 的泛素化水平而影響其降解進而促進肝癌的進展[11]。此外，在腎細胞癌中FBXO22能通過抑制MMP-9介導的遷移侵襲及血管內皮生長因子(VEGF)介導的血管生成從而阻止其遠端轉移的發生[12]。

FBXO22第一次被認識是作為一種針對甲基化p53進行降解的衰老相關E3連接酶，而后有研究表明，FBXO22通過針對賴氨酸特異性去甲基化酶4A和p53的蛋白酶體降解分別調節組蛋白甲基化標記和衰老[13-14]。此外，FBXO22能通過介導泛素依賴性降解腫瘤抑制因子——KLF4促進肝細胞癌進展。有研究表明，FBXO22基因沉默后能降低結腸癌細胞的侵襲遷移能力。在黑色素瘤細胞中下調FBXO22能引起HIF-1α/VEGF通路下調從而抑制其遷移侵襲及血管生成能力[15]。本研究通過Transwell小室細胞遷移實驗證明了FBXO22基因的表達下調后乳腺癌MDA-MB-231細胞的遷移能力明顯下降。此外，細胞劃痕實驗結果表明，FBXO22蛋白表達下調后乳腺癌MDA-MB-231細胞的侵襲能力明顯減弱。表明下調FBXO22能使乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移侵襲能力減弱。

EMT是指上皮細胞通過特定程序轉化為具有間質表型細胞的生物學過程。在慢性炎癥、胚胎發育、癌癥轉移、組織重建及多種纖維化疾病中均具有重要作用[16]。通過EMT，上皮細胞失去了細胞極性，失去與基底膜的連接等上皮表型，獲得了較高的遷移侵襲、抗凋亡和降解細胞外基質(ECM)的能力等間質表型[17]。EMT是上皮細胞來源的惡性腫瘤細胞獲得遷移侵襲能力的重要生物學過程[18]。有研究表明，間充質干細胞與乳腺癌細胞之間的相互作用可能影響腫瘤的發生、生長和轉移[19-20]。在體外脂肪源性間充質干細胞與乳腺癌細胞MCF-7共培養能引起共培養的MCF-7細胞遷移侵襲能力增強，且EMT呈時間依賴性變化[21]。還有研究表明，敲除乳腺癌MDA-MB-231細胞中長鏈非編碼RNA LincK能通過抑制EMT從而使其在裸鼠中肺轉移水平明顯下降[22]。本研究結果顯示，下調FBXO22基因的表達水平能引起MDA-MB-231細胞中E-cadherin表達水平上升，Vimentin表達水平下降。而EMT的主要特征是上皮標記物(如E-cadherin)的丟失，同時，間充質標記物如Vimentin表達增加[23]。下調FBXO22基因表達使乳腺癌MDA-MB-231細胞的上皮標記物水平增高，同時，降低了間充質標記物水平。表明FBXO22基因表達下調能抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞的EMT進程。

MMP是一種鈣依賴性含鋅內源性肽酶，可降解各種ECM蛋白[24-25]。MMP在癌癥進展中的主要意義之一是其在ECM降解中的作用，MMP-2與MMP-9一起能降解基底膜中最豐富的成分即Ⅳ型膠原，ECM降解可使癌細胞從原發腫瘤中轉移出來形成轉移灶[26-28]。有研究表明，乳腺癌MDA-MB-231細胞中MMP-2、MMP-9高表達，且在其侵襲及遠端轉移過程中具有關鍵作用[29]。此外，MMP-2與其他MMP已被證明可酶解激活轉化生長因子β(TGF-β)從而促進EMT進程，進而引發癌癥轉移[30]。本研究結果顯示，下調FBXO22基因后乳腺癌MDA-MB-231細胞中MMP-2、MMP-9表達下降，表明FBXO22基因的表達下調引起乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移侵襲能力下降的可能機制為MMP-2、MMP-9水平下降。

4 結 論

下調FBXO22基因水平能抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞的遷移侵襲能力，其可能的機制為FBXO22基因表達下調抑制了MDA-MB-231細胞EMT進程，并使細胞轉移相關重要蛋白--MMP-2、MMP-9表達減少。